抗生素效价测量的新方法微生物比浊法

[size=10.5pt]微生物比浊法[size=10.5pt]
[size=10.5pt]USP[size=10.5pt]、[size=10.5pt]BP[size=10.5pt]、[size=10.5pt]EP[size=10.5pt]、[size=10.5pt]JP[size=10.5pt]早在上世纪[size=10.5pt]50[size=10.5pt]年代开始收载比浊法。此方法在国外应用较为广泛，使用条件也较为成熟。《中国药典》[size=10.5pt]2005[size=10.5pt]版正式收录比浊法，与管碟法并列成为抗生素效价测量的标准方法之一。[size=10.5pt]
[size=10.5pt]比浊法是利用抗生素在液体培养基中对实验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对实验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。[size=10.5pt]
[size=10.5pt]比浊法受多种试验因素影响，比如：培养箱温度的准确度及均匀程度、同批样品间测量时间间隔、培养环境中氧气的含量、检测前菌液的均匀程度等均会对试验结果造成影响[size=10.5pt][size=10.5pt]。[size=10.5pt]WBS-100[size=10.5pt]微生物比浊法测定仪针对上述因素作出了特别的设计，完全适用于比浊法抗生素效价测定。


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[size=10.5pt]1[size=10.5pt]、培养过程[size=10.5pt]
[size=10.5pt]培养过程影响因素主要有温度准确性和均匀性、培养过程中的振摇、培养用试管的均匀性、培养中各个试管的摆放顺序等，这些影响因素会直接影响到实验结果的准确性，如果能尽量减小培养过程中的各个影响环节，就能保证结果的准确性。[size=10.5pt]
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[size=10.5pt]1.1[size=10.5pt]、温度
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[size=10.5pt]为了能够较准确的反映不同位置试管中细菌与抗生素作用的实际情况，必须要求培养区域内整体升温速度快，温度控制精度高，温度均匀性好。[size=10.5pt]WBS-100[size=10.5pt]微生物比浊法检定仪使用快速恒温循环空气加热方式，在保证[size=10.5pt]20-30[size=10.5pt]分钟内使试管中的溶液达到设定温度的前提下，将温度准确度控制到设定温度的±[size=10.5pt]0.1[size=10.5pt]℃[size=10.5pt]以内，培养区域内温度的均匀性控制在设定温度的±[size=10.5pt]0.3[size=10.5pt]℃[size=10.5pt]，有效地减小了温度对试验结果和技术指标造成的影响，保证了效价测定结果准确度和可信限率符合要求。[size=10.5pt]
[size=10.5pt]目前，在对温度精度及温度均匀性要求较高的恒温培养中，普遍采用了带有快速介质循环的加热方式，该加热方式反应灵敏、升温过程不易过冲、恒温过程不易波动。而原始的方法采用加热部件对培养腔直接加热，无循环装置，或仅凭加温对象在培养腔内的缓慢移动，来实现加温均匀，目前此方法大多不被采用。该方法缺点如下：首先，该方法会使温度控制产生较大的偏差；其次，加温对象在加热腔内转动的速度很慢，不足以解决瞬间温度不均匀造成的细菌培养上的差别；第三，仪器在升温时期温度容易过冲，恒温时期又容易波动。总之，微生物长时间处于波动较大且不均匀的温度环境中，其生物活性将会发生较大变化，从而影响效价测定的准确度和可信限率。[size=10.5pt]
[size=10.5pt]1.2[size=10.5pt]、振摇[size=10.5pt]
[size=10.5pt]细菌培养过程中，如果不进行振摇，会使试管上下形成氧气梯度，影响细菌生长，而在线检测前如果不进行振摇，各管由于细菌沉降会导致上下浊度不一致。[size=10.5pt]
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[size=10.5pt]梯度微生物生长区及[size=10.5pt]
[size=10.5pt]梯度代谢环境[size=10.5pt]
[size=10.5pt]培养基中的气泡对检测结果的影响[size=10.5pt]
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[size=10.5pt]正常球菌[size=10.5pt]
[size=10.5pt]胞壁破裂的细菌[size=10.5pt]
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[size=10.5pt]WBS-100[size=10.5pt]微生物比浊法检定仪采用恒温可调节力度整体振摇培养，有效防止了细菌生长时氧气浓度梯度及沉降造成的试管上下浊度不一致的情况，并且采用整体振摇方式，既保证了各个试管振摇力度一致，又避免了过度振摇导致气泡产生或菌体破裂。[size=10.5pt]
[size=10.5pt]除了整体振摇培养外，还有采用微型搅拌子搅拌的方法来实现混匀培养的目的，但我们并不推荐采用此种方法，因为此种方法除了必要的培养器皿外，额外加入了搅拌子。此方法首先会加大灭菌过程的工作量。其次，因其搅拌子数量多于搅拌驱动器的数量（因试管过小，目前的情况下不可能做到搅拌子与驱动器数量相同），不能保证每个搅拌子都能受到相同的驱动力，这样就造成了各个试管间的差别。第三，因为细菌细胞壁很脆弱，这种搅拌子直接作用于菌液中菌体的混匀方法，很容易导致细菌菌体破裂死亡，影响测量结果的准确性。[size=10.5pt]
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1.3[size=10.5pt]、拉丁方阵排列[size=10.5pt]
[size=10.5pt]2005[size=10.5pt]年版中国药典规定在培养过程中采用随机方式排列，如果不采用随机方式排列，有可能产生系统误差，导致测定结果不准确。根据国内外文献报道，比浊法测定抗生素效价时拉丁方是一种消除系统误差的最佳随机排列方式，拉丁方试验的误差方差约为随机区组实验的[size=10.5pt]73%[size=10.5pt]。[size=10.5pt]
[size=10.5pt]WBS-100[size=10.5pt]微生物比浊法检定仪采用完全正交拉丁方排列培养，有效地消除了培养过程中产生的系统误差，而且专用试管托架可以整体取出，因此在加样、培养、清洗过程中培养用比色皿不用从托架上取下，既方便了操作过程，又避免了频繁取放比色皿造成的不便及比色皿碰撞造成的破损。[size=10.5pt]
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[size=10.5pt]比浊法[size=10.5pt]4[size=10.5pt]×[size=10.5pt]4[size=10.5pt]拉丁方排列示意图[size=10.5pt]

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[size=10.5pt]如果没有采用拉丁方排列的方法，样品和标准品只能遵循一定的顺序进行排列，这样会加大培养过程中引起的误差。另外，如果比色皿在加样和清洗过程中经常从仪器托架上取出，既不方便操作，又容易导致比色皿的破损，而且装有不同浓度溶液的比色皿容易在取放过程中混淆。[size=10.5pt]
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[size=10.5pt]2[size=10.5pt]、测量过程[size=10.5pt]
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[size=10.5pt]测量过程是影响试验结果准确性的重要环节，测量过程设计是否合理直接影响试验结果的准确性，现将仪器在测量过程中采取的减小误差的方法总结如下：[size=10.5pt]
[size=10.5pt]比浊法培养时间为[size=10.5pt]3-4[size=10.5pt]个小时，此时细菌处于对数生长期，生长非常迅速。据文献报道，在该时期[size=10.5pt]2.5[size=10.5pt]分钟内细菌生长所造成的浊度增加将导致吸收度增加[size=10.5pt]0.01[size=10.5pt]。既使使用在线检测，如果测量时间过长，也会对效价测定结果和可信限率产生一定的影响。[size=10.5pt]

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[size=10.5pt]细菌生长曲线及培养时间对测量的影响[size=10.5pt]

[size=10.5pt]WBS-100[size=10.5pt]微生物比浊法检定仪使用具有专利技术的特殊光源作为浊度检测光源，它具有体积小、寿命长、几乎没有发热的优点，国外浊度测量已经开始大量使用这种光源（如美国的哈希公司、意大利哈纳公司的多款比浊仪均采用该技术）。[size=10.5pt]WBS-100[size=10.5pt]微生物比浊法测定仪充分利用了这种光源的优点，在培养箱内实现了[size=10.5pt]5[size=10.5pt]个通道同时检测，从而大大加快了检测速度，[size=10.5pt]能在[size=10.5pt]15[size=10.5pt]秒内完成[size=10.5pt]40[size=10.5pt]只试管的测量，可将因测量时间所产生的吸收度误差降低到[size=10.5pt]0.001[size=10.5pt]以下。[size=10.5pt]
[size=10.5pt]如果采用单检测器转动比色皿托架的方式检测，整批样品检测完毕约需要[size=10.5pt]3[size=10.5pt]分钟的时间，这样在最初检测和最后检测的比色皿间就会有大约[size=10.5pt]0.01[size=10.5pt]的误差，使实验结果误差增大。[size=10.5pt]
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