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Protamex复合蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究 

上一篇 / 下一篇  2009-02-27 12:22:51 / 个人分类:蛋白资料

Protamex复合蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究

     刘艳秋,陈 光*,孙 旸

     (吉林农业大学生物技术学院,吉林 长春     130118)

摘   要:为优化大豆分离蛋白酶水解条件,本试验采用二次回归正交旋转组合设计方法对Protamex复合蛋白酶水

解大豆分离蛋白的条件进行研究。建立了水解度(DH)与 pH 值、反应温度、反应时间、底物浓度、酶与底物浓

度比之间的数学模型;并获得最佳水解工艺条件:pH 值 6.5,温度 40℃,水解时间 10h,底物浓度 14%,酶与

底物浓度比4.5%;主成分分析表明,pH 对 DH 的贡献率最大。

关键词:回归旋转设计;大豆分离蛋白;Protamex 复合蛋白酶;水解

     大豆肽是以大豆蛋白为底物经蛋白酶水解后获得的   90℃温度下加热处理 10min左右,可使大豆蛋白致密的

蛋白质水解产物,它由不同分子量的多肽混合组成,     立体结构变得松散,有利于提高大豆蛋白的酶解速率,

水解产物中还含有少量游离氨基酸、糖类、无机盐      但随着底物浓度的增加和加热时间的延长,蛋白分子会

等。大豆肽具有特殊的理化特性和生理机能,如良好     通过疏水作用和二硫键作用形成网状聚合体,反而会降

热稳定性、水溶性,易消化吸收,低抗原性及促进脂     低蛋白酶解速率。结合本试验设计方案,各浓度大豆蛋

肪代谢,降低胆固醇,抗氧化等作用。近年来,以      白溶液在80℃温度下恒温水浴 15min,效果较好。

酶法水解大豆蛋白来提高其营养保健价值及加工功能特    1.4.2 水解度的检测方法[7~11]性已成为研究热点[1,2],不同研究者所选用的蛋白酶系不 大豆蛋白水解度(DH)以水解断裂的肽键数目(h)占总同或采用不同分离方法,获得了功能特性更为广泛的大    肽键数目(htot)的百分数来确定,即DH=h/htot× 100%。豆肽[3~5]。  依据 pH-stat法,蛋白水解度可由水解过程中NaOH

   但由于酶解过程中的影响因素较多,因素变化范    的消耗量来计算。计算公式如下:

围较大,如采用一般的回归分析,由于各因素所取水      DH%=B× NB×(1/α)×(1/MP)×(1/Htot)× 100

平不同,对应的各个预测值 Y 的方差不同,影响了不公式(1)同预测值之间的直接比较。为了克服这一不足,本文      式 中 :引入二次回归正交旋转组合设计方法,对中性内切蛋白     B —水解过程中所消耗的 NaOH 溶液量酶—Protamex复合蛋白酶水解大豆分离蛋白的条件进行NB —溶液的当量浓度研 究 。                        α—为α-氨基解离度,1/α=1+10^( pK - pH)   应用五因素五水平的二次回归旋转组合设计,可使    pK 为大豆蛋白质α- 氨基的pK 值

试验组合由 3125次压缩到 36 次,通过试验获得的参数,  MP —底物蛋白质的总量借助分析软件对数据进行科学处理,建立数学模型,完     Htot—每克蛋白质中肽键的克当量数(取8.38)成试验方案的模拟运算、统计分析,可筛选出最优化         1.4.3大豆蛋白的酶解操作的生产条件,并通过调控生产条件可获得较高水解度的  根据试验设计方案,称取大豆分离蛋白加入适量水

综合方案。         配制成为一定浓度的大豆蛋白溶液,经恒温水浴预处理

1 材料与方法    后,调节温度至反应温度搅拌 20min,调节 pH 值至反

                            应 pH 值,加入一定比例蛋白酶,在反应温度下进行恒

1.1 材料                      温酶解,酶解过程中需要不断进行搅拌,同时通过滴

   大豆分离蛋白(金龟2200)     吉林不二蛋白有限公

                            加 4N 的 NaOH溶液以保持反应体系pH 值恒定,反应偏

司;Protamex复合蛋白酶(食用级)     丹麦诺维信(NOVO)

                            差一般控制在±0.1。达到反应预定时间后,调节pH 至

公司,酶活力 25000U;其它试剂    均为 AR 级。

                            大豆蛋白等电点(pH4.3),之后将大豆蛋白酶解液加热升

1.2 仪器                      温至 85℃,保温 10min 使酶活力丧失,然后通过低温

   电子分析天平Sartorius BS210S型       德国赛多利斯

                            离心机在12000r/min,10℃下离心10min,除去未水解

股份公司;恒温水浴锅DSY-1-2孔型      北京国华医疗器

                            大豆蛋白和其它非溶性物质,倾倒出上清液置于 4℃冷

械厂;pH-stat装置(KF-5L发酵罐使用部分功能)     韩国

                            藏保存。记录 NaOH溶液的滴加量,利用公式(1)pH-stat

KoBio Tech Co. Ltd;低温冷冻离心机Laboratory Centri-

                            法计算水解度。

fuges 3K18型    美国Sigma公司。

                            1.4.4

                              水解条件优化试验设计

1.3 检测方法

                             在Protamex复合蛋白酶水解大豆分离蛋白时,其最

   蛋白质含量测定      凯氏定氮法;蛋白酶活力测

                            佳作用条件会随着 pH 值、水解温度(T)、水解时间(t)、

定       Folin-酚法;蛋白质水解度(DH)测定与控制     pH-

                            底物浓度([S])、酶与底物浓度比([E/S])等因素的变化会

stat法。

                            有所不同。首先通过单因素试验确定五因素的取值水平

1.4 试验方法

                            范围,然后以水解度(DH)为指标,选用5因素(1/2实施)

1.4.1

    大豆蛋白预处理                 回归正交旋转组合设计方案进行研究,以确定最佳水解

   据资料[6]介绍,浓度为5%~8%大豆蛋白溶液在85~

                            条 件 。

1.4.4.1 各因素水平及变化间距                                             表3    五因素回归旋转正交组合试验结构矩阵和结果

  单因素试验确定了各因素的零水平应取数值,分别                                       Table 3 Experiment structural matrix and DH data

为:pH=7.5,T=50℃,t=6h,[S]=10%,[E/S]=2.5%。                         pH      T       t         [S]        [E/S]     DH(%)

                                                              No.

                                                                X 1    X  2    X 3        X 4         X 5      Y

  其中,Z0j=(Z2j+Z1j)/2;△j=(Z2j-Z0j)/ γ;γ=2                      1  1      1       1          1          1        14.90

  则水解条件因素水平及变化间矩,见表 1 。                                       2  1      1       1          -1         -1       11.95

                                                              3  1      1       -1         1          -1       9.19

           表1    水解条件因素水平及变化间矩                                4  1      1       -1         -1         1        13.33

Table 1   Five influencing factors of DH and spaces between   5  1      -1      1          1          -1       13.08

                    levels of each factor                     6  1      -1      1          -1         1        15.83

              pH         T(℃)        t(h)     [S](%) [E/S](%) 7  1      -1      -1         1          1        12.16

水平

               Z1          Z2         Z3       Z4        Z5   8  1      -1      -1         -1         -1       7.59

Z2j(上水平)      8.5          60         10       14       4.5   9 -1      1       1          1          -1       13.18

Z0j(零水平)      7.5          50          6       10       2.5   10-1      1       1          -1         1        17.64

Z1j(下水平)      6.5          40          2       6        0.5   11-1      1       -1         1          1        15.34

△j(间距)        0.5          5           2       2         1    12-1      1       -1         -1         -1       13.12

                                                              13-1      -1      1          1          1        25.61

1.4.4.2 试验因素水平编码                                              14-1      -1      1          -1         -1       23.18

                                                              15-1      -1      -1         1          -1       12.95

  根据编码公式 Xj=Zj-Z0j/△j,Protamex复合蛋白酶                           16-1      -1      -1         -1         1        18.56

水解大豆分离蛋白试验因素水平编码见表2。                                          17 2      0       0          0          0        12.54

                                                              18-2      0       0          0          0        23.09

                 表2   五因素水平编码表                                19 0      2       0          0          0        12.53

    Table 2    Decisive variety X and linear coded data       20 0      -2      0          0          0        20.31

           X                                                  21 0      0       2          0          0        17.15

             1  X X2   3  X X

                            4   5  pH T(℃) t(h) [S](%) [E/S](%)

上星号臂(+γ) 2       2 2       2 2 8.5 60 10 14              4.5  22 0      0       -2         0          0        10.05

上水平(1)      1    1 1       1 1 8.0 55 8          12      3.5  23 0      0       0          2          0        12.18

零水平(0)      0    0 0       0 0 7.5 50 6          10      2.5  24 0      0       0          -2         0        13.09

下水平(-1)     -1 -1 -1 -1 -1 7.0 45 4               8      1.5  25 0      0       0          0          2        15.25

下星号臂(-γ) -2 -2 -2 -2 -2 6.5 40 2                  6      0.5  26 0      0       0          0          -2       6.73

                                                              27 0      0       0          0          0        13.65

1.4.4.3 五因素回归旋转正交组合试验设计结构矩阵                                   28 0      0       0          0          0        13.60

                                                              29 0      0       0          0          0        13.40

  试验设计3 6 个处理,结构矩阵见表3 。

                                                              30 0      0       0          0          0        13.60

                                                              31 0      0       0          0          0        13.65

2 结果与分析

                                                              32 0      0       0          0          0        13.45

                                                              33 0      0       0          0          0        13.55

  通过二次正交旋转组合试验,36 个处理组合试验测

                                                              34 0      0       0          0          0        12.75

得水解度的结果如表 3 所示。用“旋转组合设计试验数                                    35 0      0       0          0          0        12.60

据计算程序包”对数据进行处理,建立水解度与各因                                       36 0      0       0          0          0        12.65

素关系的数学模型,并通过数学模型分析获得最佳水解

                                                              D误=1.734             f误=9

条 件 。

                                                              D总=549.842         f总=35

2.1 数学模型的建立

                                                              D回=544.238         f回=20

2.1.1 回归方程的初步确立                                               D剩=5.604             f剩=15

  为考察各因素对水解度的影响,以 DH(Y)为指标,                                   D拟=3.870             f拟=6

对表 3 的试验结果进行分析,可得五因素与水解度之间                                    然后进行 F 检验:

的回归方程为:                                                       F1=(D拟/f拟)/(D误/f误)=3.3473<F0.05(6,9)=3.37

  Y=13.256 -2.610X1 - 1.495X2+1.972X3 - 0.275X4+1.924X5       F2=(D回/f回)/(D剩/f剩)=72.8378>F0.01(20,15)=3.37

+ 1.358X1X2 - 0.384X1X3+0.378X1X4 - 0.019X1X5 - 1.234X2X3 -   F 检验的结果表明,由于F1 不显著,F2 达显著水

0.129X2X4 - 0.099X2X5 + 0.071X3X4 - 0.247X3X5 + 0.631X4X5 +  平,说明二次回归方程与实际情况拟合得较好,试验

1.183X1 + 0.834X2 + 0.129X3 - 0.112X4 - 0.524X5        方程(1)

    2         2           2          2         2             误差的方差σ2 可取估计值,σ2=D剩 /f剩 =0.3736。

2.1.2 回归方程的显著性检验                                             2.1.3

                                                                回归系数的检验与数学模型的建立

  为了确定模型的实际意义,现对模型统计量进行检                                      对各回归系数进行检验,除t15、t25、t34外,回

验,其结果分别为:                                                    归系数都在不同程度上显著,剔除不显著项,因此二

次回归方程(1)可以改写为:                       水解度(Y)与 pH 值(X1)、反应温度(X2)、反应时间(X3)、

   Y=13.256 - 2.610X1 - 1.495X2 + 1.972X3 - 0.275X4 + 1.924X5

                                     底物浓度(X4)、酶与底物浓度比(X5)之间建立的二次回归

+ 1.358X1X2 - 0.384X1X3 + 0.378X1X4  - 1.234X2X3 - 0.129X2X4

                                     数学模型为:

- 0.247X3X5 + 0.631X4X5 + 1.183X1 + 0.834X2 + 0.129X3

                           2    2   2  Y=13.256 - 2.610X1 - 1.495X2 + 1.972X3 - 0.275X4 + 1.924X5

- 0.112X4 - 0.524X5                                                         方程(2)

    2      2                         + 1.358X1X2 - 0.384X1X3 + 0.378X1X4 - 1.234X2X3 - 0.129X2X4

   回归模型中显示了多项交互作用。因此,在一定             - 0.247X3X5 + 0.631X4X5 + 1.183X1  + 0.834X2  + 0.129X3  -

                                                2   2   2

范围内可运用回归方程(2)调节水解 pH 值、水解温度、         0.112X4  - 0.524X5

                                        2   2

水解时间、底物浓度、酶与底物浓度比的关系,使D H            3.2 Protamex的最佳水解工艺条件为pH6.5,温度40℃,

达到所需的水平。                             水解时间10h,底物浓度 14%,酶与底物浓度比 4.5%。

2.2 酶水解工艺的优化参数组合                     3.3 各因素对水解度的贡献率由大到小依次为:pH 对

   通过电脑模拟寻优得出水解度(DH)最高的优化组合          水解度的贡献率最大,其它因素的贡献率从大到小依次

为X1=-2,X2=-2,X3=2,X4=2,X5=2。即 Protamex

                                     为温度>酶与底物浓度比>时间>底物浓度。

酶水解大豆蛋白的最佳方案为 pH 值 6.5,温度 40℃,时

间 10h,底物浓度 14%,酶与底物浓度比为4.5%,此        参考文献:

时的水解度DH 为 48.94%。通过在最佳水解条件下进行        [1] 赵新淮, 冯志彪, 于国平, 等. 酶促水解大豆分离蛋白的

水解实际检验,其水解度DH 为 39.79%,与预测值基           研究[J]. 食品与发酵工业, 1994, (5): 7-11.

本符合。                                 [2] 曲永洵. 大豆肽的特性及其应用[J]. 中国油脂, 1996, 21

   但对于有的多因素非线性模型方程的选优,极值不              (2): 3-5.

一定存在,即使存在,它在实际上的实现频率也不一              [3] 邓勇, 吴煜欢. 微生物蛋白酶对大豆分离蛋白水解作用的

定很大,因此可采用统计选优方法加以解决,这里不                研究[J]. 食品科学, 1999, (6): 42-45.

再赘述。                                 [4] 汪建斌, 邓勇. Alcalase碱性蛋白酶对大豆分离蛋白水解

2.3 主成分分析                              作用的研究[J]. 食品工业科技, 2002, (1): 61-63.

   见前述所建立的回归模型方程(2)视为二次型,经           [5] 黄建韶, 张洪, 黄錾. 枯草杆菌蛋白酶水解大豆分离蛋白

                                       的研究[J]. 食品工业, 2002, (3): 13-15.

主成分分析,得正交变换标准方程如下:

                                     [6] 李书国, 陈辉, 庄玉亭, 等. 复合酶法制备活性大豆寡肽

   Y1=0.71X1 - 0.65X2 - 0.21X3 - 0.15X4 + 0.05X5

                                       研究[J]. 粮食与油脂, 2001, (3): 5-7.

   Y2=0.63X1 + 0.53X2 + 0.55X3 - 0.06X4 + 0.07X5

                                     [7] Jens Adler-Nissen. Determination of the degree of hydroly-

   Y3=-0.30X1 - 0.46X2 + 0.72X3 - 0.36X4 + 0.20X5

                                       sis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic

   Y4=0.04X1 - 0.27X2 + 0.35X3 + 0.77X4 - 0.46X5

                                       acid[J]. Agric Food Chem, 1979, 27(6): 1256-1262.

   Y5=0.01X1 - 0.05X2 - 0.02X3 + 0.51X4 + 0.86X5

                                     [8] Magdalena Karamac, Ryszard Amarowicz, Henryk Kostyra.

   Y′=13.26 - 3.40Y1 - 0.01Y2 + 1.02Y3 + 0.53Y4 + 1.96Y5 +

                                       Effect of temperature and enzyme/substrate ratio on the

1.88Y1  + 0.57Y2  - 0.27Y3  + 0.05Y4  - 0.73Y5 

   2      2         2      2   2       hydrolysis of  pea protein isolates by trypsin[J]. Czech J

   经分析计算,各因素对水解度的贡献率大小如                Food Sci, 2002, 20(1): 1-6.

下:pH值为3.322,T为2.962,t为2.515,[S]为1.760,

                                     [9] M C Márquez, V Fernández. pH-stat method to evaluate

[E/S]为 2.732。由此可以得出,pH对水解度的贡献率最        the heat inactivation of subtilisin inhibitor in legumes[J].

大,其次为温度、酶与底物浓度比、时间和底物浓度。               Chem Biochem Eng Q, 2002, 16(1): 31-35.

                                     [10] J Adler-Nissen. Enzymatic hydrolysis of food proteins[J].

3 结  论                                 Process Biochemistry, 1977,  July/August: 18-23.

                                     [11] Jens Adler-Nissen. Enzymatic hydrolysis of proteins for

3.1 采用二次回归正交旋转组合设计方法对 Protamex         increased solubility[J]. Agric Food Chem, 1976, 24(6): 1090-

复合蛋白酶水解大豆分离蛋白的工艺条件进行研究,在               1093.


TAG: 水解 研究 大豆 蛋白酶 复合

 

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