限制性内切酶1

一、限制与修饰（Restriction and modification）

1．限制与修饰现象
   早在50年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（host controlled specificity）。l噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表2-1）。l在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。

E.coli菌株	λ噬菌体感染率
	lK	lB	lC
E.coliK	1	10-4	10-4
E.coliB	10-4	1	10-4
E.coliC	1	1	1

    说明K和B菌株中存在一种限制系统，可排除外来的DNA。10^-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在C菌株不能限制来自K和B菌株的DNA。限制作用实际就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A成为N⁶甲基-腺膘呤，胞嘧啶C成为5'甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。

2．限制酶的发现
    在 20 世纪 60 年代，人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，首次从E.coliK 中分离到限制酶，它有特定的识别位点但没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达 1000bp 以上。
    1970 年，美国约翰·霍布金斯大学的 H. Smith 于偶然中发现，流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解E.coliDNA ，但不能降解自身 DNA ，从而找到HindⅡ 限制性内切酶。HindⅡ 限制性内切酶位点和切割位点如下：
            5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '
            3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '
    从此以后，发现的限制酶越来越多，并且许多已经在实践中得到应用。EcoRⅠ 是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：
            5' G↓AATTC 3'
            3' CTTAA↑G 5'

    限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要依据来源来定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型。命名时，依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）。如HindⅢ 限制性内切酶，Hin指来源于流感嗜血杆菌， d 表示来自菌株 Rd ， Ⅲ 表示序号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加 R 或 M ，且菌株号和序号小写。但现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写。
    1986 年下半年发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶； 1998 年发现 10000 种细菌或古细菌中存在 3000 种酶，且酶有 200 多种特异性。到 2005 年 1 月，共发现 4342 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 种，包括 Ⅰ 型、 Ⅱ 型、 Ⅲ 型限制酶各有 59 、3612 、10 种，甲基化指导的限制酶有 3 种，商业化的限制酶有 588 种，在 Ⅱ 型限制酶中共有 221 种特异性。

3．限制与修饰系统的种类
    根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。表 2-2 是各种限制与修饰系统的比较。
    Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。 Ⅱ 型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。
    Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。
    Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。
    在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme），如 N.BstNBI 。
    Ⅰ 型（type Ⅰ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，如EcoK 和EcoB 。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由hsdR、hsdM和hsdS基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。EcoK 编码基因的结构为 R2M2S 。EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2 。
   EcoB 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为甲基化位点， N 表示任意碱基。
                            TGA*（N）8TGCT
    EcoK 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点。
                            AA°C（N）₆GTGC
    但是EcoB酶和EcoK酶的切割位点在识别位点1000bp以外，且无特异性。
    Ⅲ型（type Ⅲ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到1%，如EcoP1和EcoP15。它们的识别位点分别是AGACC和CAGCAG，切割位点则在下游24-26bp处。
    在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指Ⅱ型系统中的种类。
                表2-2：各种限制与修饰系统的比较

	Ⅱ	Ⅰ	Ⅲ
酶分子	内切酶与甲基化酶 分子不在一起	三亚基双功能酶	二亚基双功能酶
识别位点	4-6bp, 大多数为回文对称结构	二分非对称	5-7bp 非对称
切割位点	在识别位点中或靠近识别位点	无特异性，至少在识别位点外 1000bp	在识别位点下游 24-26bp
限制反应与甲基化反应	分开的反应	互斥	同时竞争
限制作用是否需用 ATP	No	Yes	Yes

二、限制酶识别的序列

1．限制酶识别序列的长度
   限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基（表2-3）。当识别序列为4个和6个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基中会出现一个识别位点（4⁴=256，4⁶=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置。
                 4个碱基识别位点：Sau3AⅠ ↓GATC
                 5个碱基识别位点：EcoRⅡ  ↓CCWGG
                                   NciⅠ    CC↓SGG
                 6个碱基识别位点：EcoRⅠ   G↓AATTC
                                   HindⅢ   A↓AGCTT
                 7个碱基识别位点：BbvCⅠ   CC↓TCAGC
                                   PpuMⅠ   RG↓GWCCY
                 8个碱基识别位点：NotⅠ    GC↓GGCCGC
                                   SfiⅠ    GGCCNNNN↓NGGCC
以上序列中部分字母代表的碱基如下。
     R=A或G           Y=C或T               M=A或C
     K=G或T           S=C或G               W=A或T
     H=A或C或T      B=C或G或T          V=A或C或G
     D=A或G或T      N=A或C或G或T
2．限制酶识别序列的结构
    限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相对称的位置。EcoRⅠ 和HindⅢ 的识别序列和切割位置如下。
           EcoRⅠ  G↓AATTC                 HindⅢ  A↓AGCTT
                    CTTAA↑G                           TTCGA↑A
    有一些限制酶的识别序列不是对称的，如AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）]和BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置。
           AccBSⅠ  CCG↓CTC                BssSⅠ C↓TCGTG
                     GGC↑GAG                         GAGCA↑C
    有一些限制酶可识别多种序列，如AccⅠ识别的序列是GT↓MKAC，也就是说可识别4种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。HindⅡ识别的序列是GTY↓RAC。

   有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。如AlwNⅠ和DdeⅠ，它们的识别序列如下。
           AlwNⅠ  CAGNNNC↓TG               DdeⅠ  C↓TNAG
                    GT↑CNNNGAC                       GANT↑C

3．限制酶切割的位置
    限制酶对DNA的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和EcoRⅡ（↓CCWGG） 等；在两侧的有BcgⅠ[（10/12）CGA（N）₆TGC（12/10）]和TspRⅠ（CASTGNN↓），BcgⅠ酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有BbvⅠ[GCAGC（8/12）]和BspMⅠ[ACCTGC（4/8）]等。
         BcgⅠ ↓₁₀（N）CGA（N）₆TGC（N）₁₂↓     TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓
                ↑₁₂（N）CGA（N）₆ACG（N）₁₀↑           ↑NNGTG（C）ACNN

三、限制酶产生的末端
1．限制酶产生匹配粘端（matched ends）
    识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。若在对称轴5'侧切割底物，DNA双链交错断开产生5'突出粘性末端，如EcoRⅠ；若在3'-侧切割，则产生3'突出粘性末端，如KpnⅠ。
       NNG↓AATTCNN           EcoRⅠ       NNG         AATTCNN
                           
       NNCTTAA↑GNN                        NNCTTAA          GNN
2．限制酶产生平末端（Blunt end）
    在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV（GAT↓ATC）。产生平末端的DNA可任意连接，但连接效率较粘性末端低。
3．限制酶产生非对称突出端
    许多限制酶切割DNA产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如BbvCⅠ，它的识别切割位点如下。
               CC↓TCAGC
               GGAGT↑CG
    有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如AccⅠ，它的识别切割位点如下，其中GTAGAC和GTCTAC为非对称。
               GT↓AT/CGAC
               CATA/GC↑TG
    有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如DraⅢ和EarⅠ