实验室常用贮存液的配制参数1

一、核酸及蛋白质常用数据
化合物 分子量 λmax(pH7.0) 1摩尔溶液（pH7.0）中λmax时的最大吸收值 OD280/OD260
ATP 507 259 15400 0.15
CTP 483 271 9000 0.97
GTP 523 253 13700 0.66
UTP 484 262 10000 0.38
dATP 494 259 15200 0.15
dCTP 467 271 9300 0.98
dGTP 507 253 13700 0.66
dTTP 482 267 9600 0.71
2．常用核酸的长度与分子量
核酸 核苷酸数 分子量
λDNA 48502（双链环状） 3.0×107
pBR322 4363（双链） 2.8×106
28SrRNA 4800 1.6×106
23SrRNA 3700 1.2×106
18SrRNA 1900 6.1×105
19SrRNA 1700 5.5×105
5SrRNA 120 3.6×104
tRNA（大肠杆菌） 75 2.5×104
3．常用核酸蛋白换算数据
（1）重量换算
1μg=10-6g　　　　　 1pg=10-12g
1ng=10-9g 　　　　　1fg=10-15g
（2）分光光度换算：
1A260双链DNA=50μg/ml
1A260单链DNA=30μg/ml
1A260单链RNA=40μg/ml
（3）DNA摩尔换算：
1μg 100bp DNA=1.52pmol=3.03pmol末端
1μg pBR322 DNA=0.36pmol
1pmol 1000bp DNA=0.66μg
1pmol pBR322=2.8μg
1kb双链DNA（钠盐）=6.6×105道尔顿
1kb单链DNA（钠盐）=3.3×105道尔顿
1kb单链RNA（钠盐）=3.4×105道尔顿
（4）蛋白摩尔换算：
100pmol分子量100，000蛋白质=10μg
100pmol分子量50，000蛋白质=5μg
100pmol分子量10，000蛋白质=1μg
氨基酸的平均分子量=126.7道尔顿
（5）蛋白质/DNA换算：
1kb DNA=333 个氨基酸编码容量=3.7×104MW蛋白质
10，000MW蛋白质=270bp DNA
30，000MW蛋白质=810bp DNA
50，000MW蛋白质=1.35kb
100，000MW蛋白质=2.7kb DNA
4．常用蛋白质分子量标准参照物
（1）高分子量标准参照 （2）中分子量标准参照 （3）低分子量标准参照
肌球蛋白 分子量 磷酸化酶B 97，400 碳酸酐酶 31，00
肌球蛋白 212，000 牛血清白蛋白 66，200 大豆脻蛋白酶 21，500
β-半乳糖甘酶B 116，000 谷氨酶脱氢酶 55，000 抑制剂 　
磷酸化酶B 97，400 卵白蛋白 42，700 马心肌球蛋白 16，900
牛血清白蛋白 66，200 醛缩酶 40，000 溶菌酶 14，400
过氧化氢酶` 57，000 碳酸酐酶 31，000 肌球蛋白（F1） 8，100
醛缩酶 40，000 大豆脻蛋白酶 21，500 肌球蛋白（F2） 6，200
　 　 抑制剂 　 肌球蛋白（F3） 2，500
　 　 溶菌酶 14，400 　 　
5．常用DNA分子量标准参照物
λDNA/HindⅢ λDNA/EcoRⅠ λ/HindⅢ+EcoRⅠ pBR322/HaeⅢ
23130 21226 21227 587 123
9416 7421 5148 405 104
6557 5804 4973 504 89
4361 5643 4268 458 80
2322 4843 3530 434 64
2027 3530 2027 267 57
564 　 1904 234 51
125 　 1584 213 21
　 　 1375 192 18
　 　 974 184 11
　 　 831 124 7
　 　 564 　 　
　 　 125 　 　
续上表
pBR322/HinfⅠ φχ174/HinfⅠ φχ174/Hae Ⅲ φχ174/TapⅠ
1631 726 140 1353 2914
517 713 118 1078 1175
506 553 100 872 404
396 500 82 603 327
344 417 66 310 231
298 413 48 281 141
221 311 42 271 87
220 249 40 234 54
154 200 24 194 33
75 151 　 118 20
　 　 　 72 　
二、常用缓冲液
1．分子克隆常用缓冲液
2．磷酸缓冲液
（1）25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制※
pH 1mol/L K2HPO4(ml) 1mol/L KH2PO4(ml)
5.8 8.5 91.5
6.0 13.2 86.8
6.2 19.2 80.8
6.4 27.8 72.2
6.6 38.1 61.9
6.8 49.7 50.3
7.0 61.5 38.5
7.2 71.7 28.3
7.4 80.2 19.8
7.6 86.6 13.4
7.8 90.8 9.2
8.0 94.0 6.2
（2）25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制※
pH 1mol/L Na2HPO4(ml) 1mol/L NaH2PO4(ml)
5.8 7.9 92.1
6.0 12.0 88.0
6.2 17.8 82.2
6.4 25.5 74.5
6.6 35.2 64.8
6.8 46.3 53.7
7.0 57.7 42.3
7.2 68.4 31.6
7.4 77.4 22.6
7.6 84.5 15.5
7.8 89.6 10.4
8.0 93.2 6.8
※:用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml，根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值：
pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体])
在此，pK’=6.86(25℃)。
3．电泳缓冲液
测序凝胶加样缓冲液
98%去离子甲酰胺
10mol/L EDTA(pH8.0)
0.025%二甲苯青FF
0.025%溴酚蓝
甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。
常用的电泳缓冲液
缓冲液 使用液 浓贮存液（每升）
Tris-乙酸（TAE） 1×：0.04mol/L Tris-乙酸 50×：242g Tris碱
　 0.001mol/L EDTA 57.1ml冰乙酸
　 　 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-磷酸（TPE） 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 10×:10g Tris碱
　 0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）
　 　 40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-硼酸（TBE）a 0.5×0.045mol/L Tris-硼酸 5×：54g Tris碱
　 0.001mol/L EDTA 27.5硼酸
　 　 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
碱性缓冲液b 1×:50mmol/L NaOH 1×:5ml 10mol/L NaOH
　 1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)
Tris-甘氨酸c 1×:25mmol/L Tris 5×:15.1g Tris
　 250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3）
　 0.1% SDS 50ml 10% SDS(电泳级)
说明：
①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。
以片都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。
进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。
②碱性电泳缓冲液应现用现配。
③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2×SDS凝胶加样缓冲液：
100mmol/L Tris•HCl(6.8)
200mmol/L二硫苏糖醇（DTT）
4%SDS（电泳级）
0.2%溴酚蓝
20%甘油
不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。
4．凝胶加样缓冲液
缓冲液类型 6×缓冲液 贮存温度

Ⅰ 0.25%溴酚蓝
4℃
0.25%二甲苯青FF
40%（W/V）蔗糖水溶液

Ⅱ 0.25溴酚蓝
室温
0.25%二甲苯青FF
15%聚蔗糖(Ficoll400)

Ⅲ 0.25%溴酚蓝
4℃
0.25%二甲苯青FF
30%甘油水溶液

Ⅳ 0.25%溴酚蓝
4℃
40%(W/V)蔗糖水溶液
　 碱性加样缓冲液: 　
300mmol/L NaOH
6mmol/L EDTA

Ⅴ 18%聚蔗糖(Ficoll400)
4℃
0.15%溴甲酚绿
0.25%二甲苯青FF
使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。
选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。
5．各种pH值的Tris缓冲液的配制
各种pH值的Tris缓冲液的配制　
所需pH值（25℃） 0.1mol/L HCl的体积
7．1 45．7
7．2 44．7
7．3 43．4
7．4 42．0
7．5 40．3
7．6 38．5
7．7 36．6
7．8 34．5
7．9 32．0
8．0 29．2
8.1 26.2
8.2 22.9
8.3 19.9
8.4 17.2
8.5 14.7
8.6 12.4
8.7 10.3
8.8 8.5
8.9 7.0
某一特定pH值的0.05mol/L Tris缓冲液的配制：将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水将体积调至100ml
（2）温度对50mmol/L Tris•HCl液pH值的影响
4℃ 25℃ 37℃
8．1 7．5 7．2
8．2 7．6 7．3
8．3 7．7 7．4
8．4 7．8 7．5
8．5 7．9 7．6
8．6 8．0 7．7
8．7 8．1 7．8
8．8 8．2 7．9
8．9 8．3 8．0
9．0 8．4 8．1
9．1 8．5 8．2
9．2 8．6 8．3
9．3 8．7 8．4
9．4 8．8 8．5
（6）常用缓冲液的pKa值
缓冲液 分子量 pKa值 缓冲范围
Trisa 12.1 8.08 7.1～7.9
HEPESb 283.3 7.47 7.2～8.2
MPOSc 209.3 7.15 6.6～7.8
PIPESd 304.3 6.76 6.2～7.3
MESe 195.2 6.09 5.4～6.8
a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。
7．温度对常用缓冲液pH的影响
缓冲体系 pKa(20℃) △pKa/10℃
Mes 6.15 -0.110
Ada 6.60 -0.110
PiPes 6.80 -0.085
Aces 6.90 -0.200
Bes 7.15 -0.160
Mops 7.20 -0.013
Tes 7.50 -0.200
Hepes 7.55 -0.014
Tricine 8.15 -0.210
Tris 8.30 -0.310
Bicine 8.35 -0.180
Glycylglycine 8.40 -0.280
三、常用酶的配制
1．溶菌酶
用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于-20℃。每一小份一经使用后便予丢弃。
2．蛋白水解酶类
　 贮存液 贮存温度 反应浓度 反应缓冲液 温度 预处理
　 0.01mol/L Tris(pH7.8) 　
链霉蛋白酶a 20mg/ml -20℃（溶于水） 1mg/ml 0.01mol/L EDTA 37℃ 自消化b
　 0.5% SDS 　
　 0.01mol/L Tris(pH7.8) 　
蛋白酶Kc 20mg/ml -20℃（溶于水） 50μg/ml 0.005mol/L EDTA 37～56℃ 无须预处理
　 0.5% SDS 　
a：链霉蛋白酶是从链球菌（Streptomyces griseus）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。
b：自消化可消除DNA酶和RNA酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下：把该酶的粉末溶解于10mmol./L Tris•HCl(pH7.5)、10mmol/L NaCl中，配成20mg/ml浓度，于37℃温育1h。经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存-20℃。
c：蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）中纯化得到。该酶有两个Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA（以抑制依赖于Mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/L Ca2+而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGT（pH8.0）至终浓度为2mmol/L,以鳌合Ca2+。
3．无DNA酶的RNA酶
将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L Tris•HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。