PCR常见问题解决

PCR常见问题解决：
一般问题：
9.1 过多的DNA（每个反应超过200ng）可能会产生非特异性的PCR产物。一些分子量比较大的 DNA 出现在扩增产物的电泳图上，表明可能是用的DNA太多了。弱的扩增结果表明DNA 用少了（少于75ng）,可能会出现假阴性。
9.2 在分光光度计测DNA浓度的时候，RNA污染会使DNA浓度偏高。校正方法是，走一块0.7%的胶，并与标准的DNA比较。
9.3 降解的DNA也不会扩增出来。上述方法验证DNA的完整性。得到另一份样品，重提DNA。联系帕弗瑞公司，得到技术细节支持。
9.4 问题：什么都没有，或者有弱的对照带但没有产物，没有或阴性等位基因带子。

9.4.1 板子和PCR之间接触不好——不要用PE公司的固定器。
9.4.2 肝素抗凝——用EDTA或ACD作为抗凝剂。
9.4.3 劣质的DNA ——用PEL-FREEZ®快提试剂盒的时候，加蛋白酶重新消化，或纯化DNA样品。作为最后的一招，就是重提新鲜的DNA.
9.4.4 低浓度的DNA——用盐和酒精浓缩沉淀DNA ，再用少量的稀释液重新溶解。
9.4.5 存在抑制剂——在PCR反应前，确定DNA的质量好坏（见章节3.3）。
9.4.6 降解的DNA样品——很明显的在电泳带上有一些扫把状的污点。
9.4.7 没有校准的PCR仪——重新校准PCR 仪。
9.4.8 Taq酶活性失活——用已知的DNA样品验证其活性。
9.4.9 退火温度不是最佳——把第2步的70度降到69度，把第3步的65度降到64度。
9.5 问题：比较乱的错误：不止一处的错误的带子。
（可能的原因）
9.5.1 DNA没有充分悬浮溶解——上下吹打几次，有助混匀；或者在加热板上70度溶解10分钟。
9.5.2 在PCR 缓冲液中，DNA没有充分混匀——在分装到板子上之前，充分震荡混匀。
9.5.3 加入的混合液的量不均匀——分样的时候一定要小心。确定所有的孔中石蜡油的下面都有反应混合液。
9.5.4板子和PCR之间接触不好——不要用PE公司的固定器。
9.6 问题：假阳性
（可能的原因）
9.6.1 过量的DNA或Taq聚合酶——用紫外分光光度计测DNA浓度。
9.6.2 PCR加样到PCR开始的时间太长——PCR开始前不要超过5分钟。
9.6.3 电泳加样的顺序不正确 ——检查混合液和电泳条带的排列顺序。
9.6.4 把引物二聚体当成特异性带了——检查正确的片断大小。
9.7 问题 ：假阴性
（可能的原因）
9.7.1 没有校准的PCR仪——重新校准PCR 仪。

9.7.2 如果校准后仍然没有解决问题，用已知的同样的等位基因的样品作实验。如果仍然是阴性，请联系帕弗瑞的技术支持。
9.7.3 混合液没有滴如石蜡油下面。扩增前离心或轻轻震荡板子。
9.7.4 电泳加样的顺序不正确 ——检查混合液和电泳条带的排列顺序。
9.7.5 退火温度不是最佳——把第2步的70度降到69度，把第3步的65度降到64度
9.8 问题：全部是模糊的、有毛边的、拖拖拉拉的带子。
（可能的原因）
9.8.1 电泳胶太薄，加热的时候挥发过多——加水不上所缺的量。
9.8.2 琼脂糖没有完全化开——沸腾后多煮30秒。
9.8.3 胶太热了，电压太高了——降低电压。
9.8.4 TBE浓度太高了——应该用5X的TBE.
9.8.5 在随便的孔中有很浓的条纹，可能是由于没有混匀DNA——加样前，用8道加样器上下吹打两次混合液。
9.8.6 加样的时候，打出的速度太快，会使产物飘出来——加得慢一点，稳一点。
9.9 问题：电泳图太暗
（可能的原因）
9.9.1 忘记加溴化乙锭了，或者加错了量了——每100ml琼脂糖溶液用2μl溴化乙锭（10mg/ml）.
9.9.2 电泳胶没有紫外透射——延长曝光时间，或调整光圈。
9.9.3 相机设置不正确——延长曝光时间，或调整光圈。
9.10 问题：电泳胶太亮了
（可能的原因）
9.10.1 溴化乙锭用得太多了——每100ml琼脂糖溶液用2μl溴化乙锭（10mg/ml）.电泳槽内没必要加溴乙锭。
9.10.2 相机设置不正确——延长曝光时间，或调整光圈。
9.11 问题：偶尔有模糊的带子。
（可能的原因）
9.11.1产物飘到了孔的外面——加样吸头要正确的沿着胶孔的顺序排列。