分子生物学葵花宝典3

十一）SANGER双脱氧链终止法的原理？

答：DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。

（十二）、核酸分子杂交的原理？

答：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中个分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸和已知序列。

（十三）、影响杂交的因素？

答：1、核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复性速度越快。探针长度应控制在50-300个碱基对为好。

  2、温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较T_M值低25度。

  3、离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。

  4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的T_M值。它有以下优点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。

  5、核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性（即DNA中的碱基数）。

  6、非特异性杂交反应：在杂交前应对非特异性杂交反应位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。

（十四）、探针的种类和优缺点？

答：1、cDNA探针：通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的一种探针。

2、基因组探针：从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化为探针。

3、寡核苷酸探针：根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。

4、RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或反义RNA作为探针。

（十五）、探针的标记法？

答：1、缺口平移法：此法是利用适当浓度的DNase Ⅰ在DNA双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5末端和3末端，3末端就可以作为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的催化下，以互补的DNA单链为摸板，依次将dNTP连接到切口的3末端的羟基上，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶Ⅰ的5→3的核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。

2、随机引物法：随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针。

3、PCR标记法：在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP，这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。

4、末端标记法：只是将DNA片段的一端进行标记。

（十六）、PCR的基本原理？

答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA®单链DNA，94℃。退火：引物＋单链DNA®杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70 ℃左右， Taq DNA聚合酶以４种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物３’末端为起点的5’→3’DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。

（十七）、PCR引物设计的基本要求？

答：1、引物长度一般为15～30个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74℃,影响产物的生成。

2、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3’端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45％ -55％。3’端和5’端引物具有相似的Tm值,Tm值计算公式：Tm＝4(G+C)+ 2(A+T)

3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。

4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％，引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

6、引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3’端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。

7、引物与模板结合时，引物的5’端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。

8、引物的5’端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。

（十八）、PCR的反应条件？

答：1、PCR反应的缓冲液： 

l      Tris-HCl缓冲液

l      KCl 促进引物的退火，浓度太高时会抑制Taq DNA聚合酶活性。

l      加入BSA或明胶有利于保护TaqDNA聚合酶活性。

l      必要时加入适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高PCR反应特异性。

2、镁离子浓度 一般用量1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg 2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。   

  3、底物浓度 工作浓度20-200umol/L， dNTPs浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。在PCR反应中，4种dNTP必须以等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差并提高使用效率。

4、Taq DNA聚合酶 75-80℃时具有最高的聚合酶活性，150个核苷酸/秒；具有良好的热稳定性，95℃仍有活性，应用浓度一般为1-2.5u/100ul反应体积。

5、引物 0.1-0.5umol/L。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA片段产率下降。退火温度与引物Tm值有关，引物Tm值在55-80 ℃ 范围较为理想。

  6、反应温度和循环次数

（十九）、影响大肠杆菌系统外源基因表达的因素？

答：1、启动子的强弱；2、基因的剂量；3、影响RNA转录和翻译效率的因素：SD序列、mRNA；4、外源基因密码子的选择；5、表达产物的大小；6、表达产物的稳定性。

（二十）、大肠杆菌系统表达外源基因必须具备的条件？

答：1、要求外源基因的编码区不能含有内含子；

2、表达的外源片段要位于大肠杆菌启动子的下游，并形成正确的阅读框架；

3、转录出的mRNA必须有与大肠杆菌16S rRNA3^，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻译成蛋白质。

4、蛋白产物必须稳定，不易被细胞内蛋白酶快速降解，且对宿主无害。

（二十一）、真核细胞表达外源基因的条件？

答：1、首先必须具备哺乳动物细胞表达的功能元件。要求哺乳动物细胞表达载体带有能在真核细胞中表达外源基因的真核转录调控元件；

2、注意选择转染的受体细胞，不同类型的细胞具有不同的特性；

3、注意选择适当的选择标记。

（二十二）、转基因动物的概念、原理及应用？

答：1、概念：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。它的特点是“分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达”。

2、基本原理：将目的基因或基因组片段用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管或子宫中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能；也可以通过转入外源基因培育优良的动物品种。

3、应用：建立用于研究外源基因表达调控体系；建立医学中常用的疾病模型；培育动物新品种；药理学和药用蛋白的生产研究。

（二十三）、基因敲除的基本程序？

答：通过DNA同源重组，使得胚胎干细胞特定的内源基因被破坏而造成功能丧失，然后通过胚胎干细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。

1、 打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。

2、 胚胎干细胞的体外培养

3、 打靶载体导入胚胎干细胞

4、 同源重组胚胎干细胞的筛选

5、 基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡

6、 胚泡植入假孕小鼠的子宫中

7、 杂交育种获得纯合的基因敲除动物

（二十四）、DNA芯片的原理？

答：DNA芯片技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。其方法包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分子。

（二十五）、诱变剂的作用机制？

答：1、碱基的类似物诱发突变

2、改变DNA的化学结构

3、结合到DNA分子上诱发移码突变

4、紫外线及其他射线引起的DNA分子的变化

（二十六）、突变类型及其遗传效应？

答：1、突变类型：

①    点突变：DNA大分子上一个碱基的变异。分为转换和颠换。

②    缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。

③    插入：一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸链插入到DNA大分子中间。

④    倒位：DNA链内重组，使其中一段方向倒置。

2、突变的遗传效应：

①遗传密码的改变：错义突变、无义突变、同义突变、移码突变

①    对mRNA剪接的影响：一是使原来的剪接位点消失；二是产生新的剪接位点。

②    蛋白质肽链中的片段缺失：

（二十七）、基因治疗的策略？

答：1、基因置换或称基因矫正：特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。

   2、基因添加或称基因增补：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。

3、基因干预：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。

1、 基因标记：基因标记实验是基因治疗的前奏，并不在于直接治疗疾病而是期望能够提供有关正常细胞生物学和疾病病理方面的信息。

 （二十八）、基因诊断常用的生物学技术。

 （二十九）、简述重组DNA技术的过程。