氨基酸分析仪现状

对论坛中有关氨基酸分析的帖子粗略浏览了一遍，发现两个特点：一是到论坛中来发帖子的主要还是使用HPLC来做氨基酸分析，二是提到的专用氨基酸分析仪似乎只有“日立”。
氨基酸分析无疑具有极高的价值（极端一些的说，大部分蛋白分析都是应该被氨基酸分析所取代的），同时也有相当的难度。正因为如此，国内的氨基酸分析发展才表现出一方面发展势头很好，另一方面真正把氨基酸分析工作做好的又不多。较HPLC而言，专用的氨基酸分析仪方法简单、单样成本低、干扰少、稳定性好，尽管仪器本身比HPLC要贵得多，也势必成为今后氨基酸分析的主力。
有一篇帖子提到，“日立的氨基酸分析仪是世界上最好的”，真不知他/她是如何得来这个结论。没有调查就没有发言权，没有比较，如何能得出结论？做氨基酸分析的人基本都是知道日立的，因为日立做氨基酸分析仪已有几十年；然而，除了日立，他们还知道哪些氨基酸分析仪厂家呢？诸多原因导致欧美的氨基酸分析仪迟迟未能进入中国市场，而凭借日元贷款项目和援助项目的独有优势，日立在中国用户心目中已经悄然建立起“氨基酸分析仪＝日立”的心里暗示。但日立的氨基酸分析仪真的这么好吗？在北京一家同时拥有四种氨基酸分析仪（现在为3种）的单位，他们对日立L－8800的看法是“一般”，“分离效果和长期稳定性不如××仪器”……我不能说以偏概全，但对比总是难能可贵。
我并非要写些东西来宣传我们的产品，因为好的东西总是需要经历一段必不可少的市场认可周期，但对于从事氨基酸分析工作的广大用户，他们需要中国的氨基酸分析仪市场是一个充满竞争的市场，而不是一家独“show”的市场，只有充分的竞争才能为他们带来技术更高、性价比更优的仪器。

氨基酸直接分析法原理及应用
丁永胜 牟世芬
中国科学院生态环境研究中心, Dionex 中国有限公司应用研究中心 北京 100085

提 要 本文介绍一种新型氨基酸分析方法—离子交换色谱-积分脉冲安培法(HPIC-IPAD)，详细讨论方法的原理和应用，该方法与传统方法比较，无须进行柱后或柱前衍生反应，可以对氨基酸直接进行分析，灵敏度高，大多数氨基酸的最小检测限均小于1pmol，线性范围可以达到3个数量级以上。
关键词：氨基酸，离子交换色谱-积分脉冲安培法
1 前言
目前，氨基酸分析方法主要有两种类型：1）阳离子交换分离, 茚三酮（Ninhydrin）或邻苯二甲醛（OPA）柱后衍生反应，分光光度法或荧光法检测[1]；2）反相色谱分离，柱前衍生，荧光检测，常用的衍生试剂有AQC(6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl-carbamate)，FMOC(9-fluorenylmethylchloroformate)，Dabsyl(4-di-methylamino-azobenzene sulfonylchloride)，Dansyl等。这些方法的缺点是操作繁琐，氨基酸衍生物不稳定，衍生反应的副产物和试剂本身的干扰及衍生试剂昂贵等[2]。本文介绍Dionex公司新近推出的氨基酸直接分析仪是基于阴离子交换分离机理，积分脉冲安培法检测，无需衍生反应。
2 方法原理
2.1 阴离子交换分离
迄今为止，自然界中已发现180多种氨基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种，称为基本氨基酸。这些氨基酸的基本结构通式如下：
H

R—C—COO -

NH3+
氨基酸具有两性离子结构，在酸性介质中，以氨基阳离子状态存在；在碱性介质中，以羧基阴离子状态存在，这也是氨基酸分离分析方法的基础。阴离子交换树脂含有的碱性基团-N(CH3)3OH（强碱型）或-NH3OH（弱碱型）可以解离出OH-，能和溶液中的氨基酸阴离子发生交换。氨基酸与树脂的亲和力，主要取决于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧连与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用和氨基酸的空间构型。在pH 12~13，氨基酸与阴离子交换树脂之间的静电吸引的大小次序是酸性氨基酸>中性氨基酸>碱性氨基酸,因此氨基酸的洗脱顺序大体是碱性氨基酸,中性氨基酸和酸性氨基酸。氨基酸的全部洗脱顺序如图1所示。流动相由纯水、0.25M NaOH和 1.0M NaAC三种常见的溶液组成，表1列出了分析氨基酸的典型梯度淋洗条件[3]。其中氢氧化钠不仅提供淋洗离子OH-，而且碱性pH条件也是氨基酸在金电极表面进行氧化反应，实现积分脉冲安培检测的必须条件。醋酸根离子（Ac-）对固定相的亲和力大于OH-，具有较强的洗脱能力，对于保留较强的氨基酸起“推”的作用。

表1 氨基酸分析的典型梯度淋洗条件
Table 1　Typical　Gradient Conditions For Analyzing Amino Acid in Hydrolysates
时间
Time（min）        E1        E2        E3        备注（流速：0.25mL/min）

初始

0.00
2.00

8.00
11.00
18.00
21.00
23.00
42.00
42.10
44.10
44.20

75.00        76

76
76

64
64
40
44
14
14
20
20
76

76        24

24
24

36
36
20
16
16
16
80
80
24

24        0

0
0

0
0
40
40
70
70
0
0
0

0        装样

阀切换进样
开始OH-梯度淋洗, 阀复位

开始醋酸钠梯度

用高浓度氢氧化钠冲洗柱子

系统开始重新平衡,恢复到初始状态

注：E1= 纯水， E2= 0.25 M NaOH， E3= 1.0 M NaAc
2.2脉冲积分安培检测
在pH 12~13溶液中，在金工作电极和pH-Ag/AgCl参比电极之间施加一个较高的电位，α-氨基酸在金电极表面被氧化，大多数氨基酸开始先被氧化为亚胺（1），然后进一步氧化为腈基化合物（2），另外，少量的亚胺发生水解生成醛类化合物（3）。反应过程如下[4]：
（1） R-CH(NH2)COO- → R-CH=NH + H+ + 2e-
（2） R-CH=NH → R-CN + H+ + 2e-
（3） R-CH=NH + H2O → R-CHO + NH3
氨基酸的脂肪侧链抑制氨基酸的氧化反应（如亮氨酸和异亮氨酸），而氨基酸侧链中的羟基（丝氨酸和苏氨酸）、酰胺基（天门冬氨酸）和咪唑基（组氨酸）有利于这些氨基酸的氧化反应。在金电极上得到氨基的最大氧化电流所需的电位超过金表面氧化的电位，在高电位时，金电极本身形成表面氧化层和氨基酸氧化产物的附着，金电极会很快失效。金电极表面氧化时所产生的电流无疑会增加背景和基线噪音以及基线的不稳定性。为了增加氨基氧化时所产生的检测信号，抑制金电极氧化所产生的背景信号，1989年Johnson等人[5]引入了一个新的技术—积分脉冲安培。与脉冲安培相似，积分脉冲安培法中加到工作电极上的也是一种自动重复的电位对时间的脉冲电位波形，其不同之处是采样时的电位不是恒定的，而是在高-低值之间扫描。在高电位时，氨基和金的氧化同时发生。在高电位时所形成的氧化金在低电位时被还原。因为在低电位时金的氧化是可逆的，而氨基的氧化是不可逆的，因而来自金电极氧化的信号被大大抵消，由积分整个高-低循环的电流所得到的信号仅仅是被分析成分的信号。
Alan P. Clarke等人[6]经过对检测氨基酸和氨基糖的施加电位波形的优化克服了基线漂移，改进了线性、信噪比和长时间的重复性，而且不损坏金工作电极。新的波形如图2所示。首先采用较低的电位E1和E2为吸附/引发区，保持电极的活性。在较高电位E3和E4进行积分区，此时金电极表面会形成一层单分子AuOH催化膜，可以促进氨基酸的氧化反应。E5和E6为清洗活化电位，去除金电极表面的反应产物。每个电位的持续时间影响氨基酸测定的灵敏度、线性范围、色谱峰对称性和基线，总的积分时间约为450ms。

Time(ms) Pot. Integ
0.00 -0.20
0.04 -0.20
0.05 -0.05
0.11 -0.05 Begin
0.12 +0.28
0.41 +0.28
0.42 -0.05
0.56 -0.05 End
0.57 -2.00
0.58 -2.00
0.59 +0.60
0.60 -0.20

图2 测定氨基酸的积分安培电位波形图
Fig 2 Integrated amperometry waveform. used to detect amino acids.

3 应用
样品的前处理方法在氨基酸分析中具有重要的地位。由于能够直接用于分析的样品有限，样品中的氨基酸大多以蛋白质，多肽的形式存在，需要进行前处理，包括样品的提取，纯化和水解。表3列出了常用的4种水解方法，这些方法处理的样品都能在Dionex公司的AAA-Direct氨基酸直接分析系统上进行分析。

表3 氨基酸样品分析的水解方法
方法         适用范围
6M HCl 介质中110C水解6~72小时

        最常用的水解方法
缺点：丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸和甲硫氨酸的回收率较低；色氨酸被破坏。
加入还原剂巯基乙酸，可减少甲硫氨酸和色氨酸的损失

硫酸粘杆菌素

DAB:2,4-二氨基丁酸
定义
硫酸粘杆菌素是一种多肽硫酸盐，产生于芽孢杆菌粘杆菌素菌种或用其他的方法获得。
包括：
—— 粘杆菌素E1,E2,E3,E1-I和E1-7MOA的总含量：≥77.0%(干基)
—— 粘杆菌素E1-I：≤10.0%(干基)
—— 粘杆菌素E1-7MOA：≤10.0%(干基)
—— 粘杆菌素E3: ≤10.0%(干基)
性状
外观：白色或类白色粉末，具有吸湿性。
溶解性：溶于水，微溶于乙醇，几乎不溶于丙酮。
鉴别
第一种鉴别方法：B，E
第二种鉴别方法：A，C，D，E
A.        薄层色谱法（2.2.27）
测试溶液的制备：取5mg测试品，加入1ml盐酸和水（1：1）的混合溶液溶解，将溶液置于密封的试管中，加热到135℃，保持5小时。放在水浴上蒸干，继续加热直至湿润的蓝色石蕊试纸不变红为止。在0.5ml水中溶解残渣。
对照品溶液（a）的制备：取20mg亮氨酸，用水溶解，然后用相同的溶剂稀释到10ml。
对照品溶液（b）的制备：取20mg苏氨酸，用水溶解，然后用相同的溶剂稀释到10ml。 1/5
欧洲药典4.6 硫酸粘杆菌素

对照品溶液（c）的制备：取20mg苯丙氨酸，用水溶解，然后用相同的溶剂稀释到10ml。
对照品溶液（d）的制备：取20mg丝氨酸，用水溶解，然后用相同的溶剂
稀释到10ml。

薄层板：TLC硅胶G板
流动相：水-苯酚（25：75 ）
在避光条件下进行如下操作：
进样量：在10mm 谱带中点5µl。
预处理：将薄层板放在色谱柱中，这样它不会与流动相接触，密封柱盖，使薄层板在流动相的蒸汽中浸润至少12小时。
展开长度：超过12cm
干燥：在100-105℃ 的条件下干燥。
检测方法：向薄层板喷射茚三酮溶液，然后在110℃下加热5分钟。
检测结果：用测试品溶液得到的主要斑点和用对照品溶液（a）和（b）得到的主要斑点在位置、颜色和尺寸上相似，但是和用对照品溶液（c）和（d）得到的主要斑点不一致。用测试品溶液得到的色谱也显示一个非常低的Rf值（2，4-二氨基丁酸）。
B.        检查含量检测的色谱图
结果：在测试品溶液得到的HPLC色谱图中，粘杆菌素E1和E2的峰在残留时间上和用对照品溶液（a）得到的峰一致。
C.        取约5mg测试品，用3ml水溶解。加入3ml稀释的氢氧化钠溶液。摇动，加入0.5ml 10g/l的硫酸铜溶液，溶液应显紫色。
D.        取约50mg测试品，用1ml 1M盐酸溶解，然后加入0.5ml 0.01M碘，溶液保持有色的。
E.        呈硫酸盐（2.3.1）反应（a）。

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欧洲药典4.6 硫酸粘杆菌素

检查
PH（2.2.3）：4.0-6.0
取0.1g测试品，用不含CO2的水溶解，然后用相同溶剂稀释到10ml。
比旋光度（2.2.7）: -63°到-73°（干基）
取1.25g测试品，用水溶解，然后用相同溶剂稀释到25.0ml。
相关物质：液相色谱法（2.2.29）:用归一化法。
测试溶液：取25.0mg测试品，用40ml水溶解，然后用乙腈稀释到50.0ml。
对照品溶液（a）：取25.0mg硫酸粘杆菌素标准品，用40ml 水溶解，然后用乙腈稀释到50.0ml。
对照品溶液（b）：用乙腈-水（20：80）的混合溶液100ml将1.0ml对照品溶液（a）稀释到100.0ml 。
色谱柱：
--- 尺寸：长度= 0.15m, 直径=4.6mm
--- 固定相：色谱用封端十八碳烷基硅胶柱（3.5µm）
--- 柱温：30℃
流动相：将22倍体积的乙腈和78倍体积按下述方法制备的溶液相混合：取4.46g无水硫酸钠，用900ml水溶解，加入2.5ml磷酸，用水稀释到1000ml（PH2.3 ～2.5）
流速：1.0ml/min
检测：用分光光度计在215nm处检测。
进样量：20µl
运行时间：粘杆菌素E1 保留时间的1.5倍。
和粘杆菌素E1相比的相对保留时间（保留时间=约16分钟）：
粘杆菌素E2= 约 0.45; 粘杆菌素E3=约0.5; 粘杆菌素E1-1=约0.8; 粘杆菌素E1-7MOA= 约1.1.
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系统适用性实验：
对照品溶液（a）
--- 分离度：粘杆菌素E2和粘杆菌素E1峰之间的分离度最小为8.0，粘杆菌素E2和粘杆菌素E1-I峰之间的分离度最小为6.0，粘杆菌素E1-I和粘杆菌素E1
峰之间的分离度最小为2.5，粘杆菌素E1和粘杆菌素E1-7MOA峰之间的分离度
最小为1.5。
--- 用对照品溶液（a）所得到的色谱图和用硫酸粘杆菌素标准品得到的色谱图是一致的。
限量：
--- 任一杂质：≤4.0%
--- 总杂质：≤23.0%
--- 可忽略不计的杂质：在用对照品溶液（b）得到的色谱图中，粘杆菌素E1的峰面积，粘杆菌素E2，E3，E1-I，E1和E1-7MOA的峰可以忽略不计。
硫酸盐：16.0%～18.0%(干基)
取0.250g测试品，用100ml水溶解，然后用浓氨水将溶液的PH值调节为11。加入10.0ml 0.1M 氯化钡和约0.5mg 邻甲酚酞络合剂。用0.1M依地酸钠盐滴定，当溶液颜色开始变化的时候加入50ml乙醇，并继续滴定直到蓝紫色消失为止。
1ml 0.1M 氯化钡相当于9.606mg SO4。
干燥失重（2.2.32）: ≤3.5%，取1.000g测试品，在60℃温度和不超过670Pa的压力条件下用P2O5干燥3小时。
硫酸盐灰份（2.4.14）：≤1.0% ，用1.0g测试品进行检测。

含量
除了下列内容有变化以外，含量的检测方法和检测相关物质的液相色谱法（2.2.29）都相同： 4/5

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进样：测试品溶液和对照品溶液（a）。
用对照品溶液（a）得到的色谱图和硫酸粘杆菌素标准品的含量来计算粘杆菌素E2，E3，E1-I，E1和E1-7MOA的总含量和粘杆菌素E1-I和E1-7MOA的百分比含量。

贮藏
密闭容器中，避光。