实验

实验题目：显微镜技术　　　　　　　　　　　　教  师：陈亚光                     

实验类型：基本技术                                     学  时：6              　　　

内    容：

一、实验目的

了解体式显微镜、生物显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光倒置显微镜和干涉差显微镜的构造原理，并掌握其使用方法。

二、试剂和器材

体式显微镜、生物显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光倒置显微镜、干涉差显微镜、载玻片、盖玻片、乙醇、香柏油、二甲苯、滤纸条、醋酸、磷酸二氢钾、染色缸、永久制片等。

三、实验内容

1.体视显微镜的构造与使用方法

2.生物显微镜的构造与使用方法

3.暗视野显微镜的构造与使用方法

4.相差显微镜的构造与使用方法

5.荧光倒置显微镜的构造与使用方法

6.干涉差显微镜的构造与使用方法

四、关键步骤与注意事项

1. 镜头上更多的较顽固的污迹要用干净的软棉布，镜头纸或纱布蘸上无水乙醇或甲醇轻轻地擦去。

2. 从油镜上擦去浸油，应使用镜头纸、软棉布或纱布，蘸上二甲苯轻轻擦去。

3. 使用100X物镜时，标本与物镜之间充满显微镜用油；用40X、100X甘油荧光镜时，应在物镜与标本之间充满甘油。

五、思考题

 　　　1.物镜的种类各具有何种特点?

2.柯勒照明法及其实质?

3.显微镜的各种能力之间有何关系?

4.为什么暗视野照明的视场暗黑，样品影像明亮?

5.使用暗视野照明时，为什么必须在聚光器与载玻片间进行油浸?

6.如何进行暗视野聚光器的调中和聚焦?

7.相差显微镜有哪些特有的附件，其构造如何?

8.为什么相差显微镜可以直接观察活体样品?

9.干涉显微镜适用观察哪种标本?

10.荧光显微镜为什么要以汞灯当光源?

11.激发滤片和阻断滤片的功能及其区别?

实验题目：离心技术                              教  师：程瑛琨

实验类型：基本技术　                             学　时： 4　　　　

内　　容：

一、仪器设备  低速离心机、低速冷冻离心机、高速离心机、高速冷冻离心机、落地式大容量冷冻离心机。

二、仪器结构 

三、原   理   在离心力场的作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降（或漂浮）速度。

四、适用范围  微生物菌体、大分子蛋白质、酶反应液或各种提取液，常常是由固相（固形物）与液相组成的悬浮液。

五、操作方法 

1、 接通离心机电源，打开机器开关，等待机器自检完毕；

2、 按open键（机器电子锁开），打开机器盖；

3、 根据使用需要选择合适的转子，将转子轻轻地套在旋转轴上，用六角螺丝刀旋转转子上的螺母，将转子固定。

4、 根据转子选择适合的离心管，将样品装入一对离心管后，在托盘天平上调节使它们质量相等，然后对称的放入转子中，先将转子的盖子旋紧，然后盖上机器盖。

5、 根据需要依次设置离心所需要的温度、运行程序（可不选择）、转速、离心时间（当触及某一项的按键时，显示屏上相对应的值会闪烁，设完一个参数可直接触及下一个按键，继续设定所需数值），设置结束后按“start/stop”开始运行机器。

6、 离心结束后，转子会逐渐地停下来，“open”键指示灯亮起，按此键打开离心室，旋开转子盖，取出样品。

7、 将离心管处理干净，倒置在小张滤纸上使其干燥，以便下次使用。旋上转子盖，关上机盖。若离心室内壁有冰霜待其化净干燥后，再旋上转子盖，关上机盖。

五、注意事项

1、  离心机移动后，最好4小时后再使用。转子长期不使用，应取出。使用时在旋转上涂抹润滑油。

2、 使用离心机时对称放置离心管，且质量相等。机器运行前检查转子盖、机器盖是否盖好。

六、思考题

    1、离心机适用范围如何？

    2、使用离心机时应该注意哪些？

实验题目：光谱分析技术　　　　　　　　　  　教  师：程瑛琨

实验类型：基本技术   　                      学  时：6　　　　　

内　　容：

一、仪器设备  721、723可见分光光度计、752紫外可见分光光度计、UV－2401PC紫外可见分光光度计、UV－3150PC紫外可见近红外分光光度计、RF-5301PC荧光分光光度计、比色液及标准溶液、滤纸等。

二、仪器结构 

三、原　　理

光谱仪器是一种简单易用的分光光度法测定通用仪器，不同型号的机器测定的波长范围不同，可以根据自己的需要选择要使用的仪器。

不同型号的光谱仪器的构造有很大的差别，但是其基本原理是相同的。根据溶液中各种成分对透过光的吸光度不同，在一定范围内，吸光值（或者透过率）与溶质的浓度成正比（玻尔定律）。通过准确浓度的标准品对应其吸光值（透过率）作图，我们就可以得到一条标准曲线。测定未知浓度的待测样品的吸光值（透过率），与标准曲线相比较就可以得到其浓度。

四、适用范围

可广泛用于医学卫生、临床检测、生物化学、石油化工、环保检测、质量控制等方面作定量、定性分析。

具体到我们实验室，可以对多糖、蛋白、核酸等物质进行定性、定量测量。同时UV－3150PC紫外可见近红外分光光度计还可以测量近红外区的固体、液体样品的吸收光谱，RF-5301PC荧光分光光度计可以测定荧光物质的发光强度光谱，同时他们自带的软件可以方便的进行数据处理与分析。

五、操作步骤

我们以UV－3150PC紫外可见近红外分光光度计为例讲述光谱仪器的性能和操作方法。

1、  插上电源，打开光度计前面的电源开关。

2、  双击计算机桌面UV Probe图标，打开UVProbe软件，点击UVProbe中“Connect”图标联机，出现自检画面。

3、  如自检完全部绿灯亮，则点击“OK”进入系统。若出现红灯亮，可关掉光度计重新连接，若仍未通过自检，应立即报告仪器负责老师。

4、  完全通过并进入系统，出现UVProbe菜单栏和工具栏。UVProbe有四大主要模块，包括光谱扫描模块、光度测量模块、时间扫描模块和报告生成器。每种模式都可以直接点击后面的方法设定按钮设置方法。

5、  点下光谱扫描图标，出现光谱扫描界面。

6、  点击方法按钮，出现方法设置对话框。在此可以设置扫描波长范围，仪器的最大范围为3200～190nm。可以设置扫描速度，一般可选中速（Medium）或快速（Fast）进行扫描。采样间隔表示光度计每隔多少nm读一个吸光度值，如没有特殊要求，选择自动即可。可选择是否重复扫描曲线，若重复则设置重复次数和间隔时间。

7、  点击“Sample Preparation”输入样品信息。包括样品的质量、体积、稀释倍数和测量光程等。也可以输入样品的其他信息。

8、  点击“Instrument Parameters（仪器参数）”设置测量方式和仪器的一些参数。在测量模式中可选择“Transmittance（透过率）”、“Absorbance（吸光度）”、“Energy（能量）”和“Reflectance（反射）”，其中Reflectance一般用积分球测定固体样品时使用。狭缝设置在3200～800nm下设为5nm，在800～190nm 设为2nm。若包括这两个范围的波长如1500～500nm则选择狭缝为5nm。

9、  换灯和检测器可根据所测样品进行设置，换灯在393～282nm范围内任意值均可，换检测器在895～750nm范围内任设一个值即可。但换灯和检测器由于仪器进行机械的移动，会造成信号波动较大，称仪器噪音大，此时所得扫描曲线误差较大，所以所设波长应该避免在样品吸收峰位置以免影响测定值。

10、              所有参数设置完成后，两个样品架均不放置样品或两个均放上同样的空白溶液，点击“Baseline”，开始进行基线校正，仪器扫描完成后，点击“λ Go To WL”将波长转到750nm，点击“Auto Zero”把750nm的波长设为0。点击“Start”再次扫描，若得出曲线最值均小于0.001，则认为基线平坦，若数值较大，则将750nm吸光度设为0重新进行基线扫描。

11、              基线校正完成后，取出样品架的空白溶液，放入样品溶液，点击“Start”开始扫描曲线。扫描完成后，出现保存路径框和文件名框，设置好后出现扫描曲线。

12、              曲线扫描完成后，在谱图上点击鼠标右键，出现快捷菜单。点击“Auto Scale”可是软件自动调节图像坐标使之适合扫描所得数据。点击“Cross Hair>Display”鼠标显示为交叉线，用鼠标将交叉线放到曲线上某点即可显示该点的波长和吸光度值。

13、              点击“Label”可以在谱图上添加标签，可在其中输入文本以标记谱图。点击“Legend”出现各数据保存图，若在前面框里勾选该光谱数据，则在左面重叠图上显示其曲线。

14、              若从右键快捷菜单中选择“Customize（自定义）”，可以自定义曲线显示颜色还可定义坐标轴的数值。

15、              得出曲线后可以对谱图进行一系列的处理。

（1）       点击“Data Print（显示数据）”图标可以将谱图曲线直接显示为数值。

（2）       点击“Manipulate（运算）”图标，可以进行加减乘除、差谱、扣除空白、倒数光谱、对数光谱等处理。

（3）       点击“Peak Point（显示峰值）”按钮显示“波峰”和“波谷”的数值。

（4）       点击“Point Pick”图标，输入要显示的波长值，立即显示出所输入波长处的吸光度值。

（5）       点击“Peak Area”，设定峰阈值，即显示大于此阈值的峰区域。

（6）       点击“Sewing box（裁缝）”图标，可以进行谱图的裁剪和缝合。

16、              光谱曲线扫描完成后数据实际直接保存在内存中，并没有保存到硬盘上，此时若关闭窗口，电脑会提示“Some Spectrum data has not been saved! Do you still want to exit and lost unsaved change？（还有光谱数据尚未保存，你是要离开而不保存数据吗？）”选择“No”返回主界面保存所有数据。

六、注意事项

1、  光度计灯源寿命有限，若长时间不测量，应通过UVProbe软件断开连接（点击“Disconnect”），然后关闭光度计电源。

2、  使用分光光度计时要保证样品室绝对干净，小心放入样品，放入比色皿前一定要先用滤纸和擦镜纸将比色皿外表面擦干净，不要污染样品池和光度计外表面。

3、  仪器自检和扫描的过程中，不要打开样品室盖。

4、  软件不会自动保存数据，所有的数据要保存都必须点击“Save”或者“Save As”进行另存。否则数据会丢失。

5、  认真填写贵重仪器使用记录。

七、思考题

1．干扰测定结果的因素有哪些？

2．为了更好的维护和保养仪器，我们在使用的过程中应该注意哪些方面？

实验题目：层析技术                        教    师：逯家辉

实验类型：基本技术　                      学　　时：8　　　　　　

内　　容：

一、仪器设备  紫外检测仪、蠕动泵、记录仪、ATK层析系统、层析柜、树脂、样品等。

二、仪器结构 

三、原　　理

    由于填料的不同，各个实验室所使用的层析技术的原理也不完全相同。但不外乎以下几种基本原理：分子筛作用、离子交换作用、亲和层析作用等等。分子筛作用是由于填料上有一定规格的孔径，分子量大小不一样的样品流过柱子时所受到的作用力不一样，所走的路径也不同，所以流出柱子的时间也就有了差异，不同组分得以分开。离子交换是由于正负电荷的吸引而使样品挂在填料上，改变溶液环境，使样品分子所带的电荷产生变化，从而被洗脱下来，不同组分与柱料的吸附作用力时不同的，从而洗脱条件也是不同的。亲和层析就是柱料与被分离样品特异性的吸附结合一起，从而使被分离物质与其他成份分离开来。

四、适用范围

1．蛋白质分子量的测定。

2．蛋白质的分离纯化

3．多糖的分子量测定

4．多糖的分离纯化

五、操作步骤

1．柱料的前处理

2．选择合适直径与长度的层析柱，装柱

3．装完柱之后就连上紫外检测器，检验260nm处的吸光值。

4．用上样缓冲液平衡柱子。

5．将样品液浓缩后上样，

6．洗脱液洗脱，部分收集器收集各个组分。

7．分别测定各个组分的浓度和含量。合并活力峰。

七、注意事项

1．柱料前处理一定要彻底，完全，将杂质全部除去。

2．上样之前柱子平衡要过夜。

3．分子筛层析时点样量不能过大，柱面一定要平。

4．上样、洗脱时一定要对目标产物跟踪去向。

七、思考题

1．分子筛层析、离子交换层析样品在流经柱子的时候都受到哪些力的作用？

2．分子筛层析、离子交换层析对柱料前处理、上样和洗脱的要求有何不同？

3．如果两种组分分离不开，试解释其可能的原因？

4．上样之前如果不进行平衡，会对结果产生什么影响？

实验题目：图像采集与分析技术                 教    师：逯家辉

实验类型：基本技术　                        学　　时：　6        　　　

内　　容：

一、仪器设备   凝胶成像分析系统  ChemiGenius2

二、仪器结构

三、原　　理

样品在电泳凝胶或者其他载体上的迁移率不一样，以标准品或者其他的替代标准品相比较就会对未知样品作一个定性分析。这个就是图像分析系统定性的基础。根据未知样品在图谱中的位置可以对其作定性分析，就可以确定它的成份和性质。

样品对投射或者反射光有部分的吸收，从而照相所得到的图像上面的样品条带的光密度就会有差异。光密度于样品的浓度或者质量成线性关系。根据未知样品的光密度，通过于已知浓度的样品条带的光密度指相比较就可以得到未知样品的浓度或者质量。这就是图像分析系统定量的基础。

采用最新技术的紫外透射光源和白光透射光源使光的分布更加均匀，最大限度的消除了光密度不均造成的对结果的影响。

四、适用范围

1．蛋白质、核酸、多肽、氨基酸、多聚氨基酸等其他生物分子的分离纯化结果作定性分析。

2．可以确定生物分子的分子量。

3．可以应用于生物分子的定量分析中。

五、操作步骤

1．打开凝胶成像系统开关。

2．打开电脑，系统自动打开并进入GeneSnap软件。

3．打开凝胶成像系统前面板，选择使用紫外透射光源或者白光透射光源，将相应光源安放到位。

4．将样品放置在透射光源的样品台上。

5．在GeneSnap操作界面里面选择使用Upper white光源，点击绿色（即时成像）按钮。                                                                                                                                                                        

6．根据右侧成像窗口中显示的即时照片，手动调节凝胶在样品台上的位置，直至成像窗口中凝胶在照片的中央位置，关上凝胶成像系统的前面板。

7．选择紫外光源：       No Light              不使用灯照射，直接成像

Transilluminator        紫外透射光源

Epi long wave uv       长波紫外反射光源（365nm）

Epi long wave uv       短波紫外反射光源（254nm）

Upper white           顶部白色反射光源

Lower white           底部白色透射光源

8．E.D.R.及N.F.的选择：  E.D.R.       动态范围扩展，可以使照片由

12 位变为16位，更加清晰

                         N.F.        中间部分区域校正，可以消除背景光

分布不均造成的影响

9．选择照相时所使用的灵敏度：High resolution         高分辨率

                             Medium sensitivity       中灵敏度

                             High sensitivity          高灵敏度

                             Max sensitivity          最高灵敏度

10．            选择使用的滤光片：   No Filter    适用于可见光、荧光

和化学发光物质的照相

                             EtBr/UV   适用于紫外光照相

11．            点击绿色（即时成像）按钮，按钮变为红色，成像窗口出现即时照片。

12．            调整照相机光圈大小，使看到的凝胶照片亮度正合适。

13．            调整图片放大/缩小倍数，使所照凝胶所成的照片大小与成像窗口大小相适应。

14．            调整照相机的焦距，使凝胶所成的照片最清晰。

15．            设置曝光时间，使所成的照片清晰、亮度适中。

16．            点击红色按钮，冻结图像并且在成像窗口中显示（freeze image as current view in image window）。

17．            调整预览照片的亮度（Reset brightness），使照片明亮清楚。

18．            调整预览照片的对比度（Reset contrast），使照片上的图案更加。

19．            调整预览照片的灰度（Reset gamma），使照片更加清晰。

20．            把各个参数都调节到最佳之后，保存照片。  Toggle false color view Show saturation

六、注意事项

1．紫外凝胶照相时要防止EB污染仪器，在紫外透射灯样品台上垫上蓝色和白色胶片，开关凝胶成像系统前面板那、操作GeneSnap软件之时都不可以戴手套。白光透射光源放置在紫外透射光源上面时要把蓝色和白色胶片取出。

2．注意开机顺序，先开凝胶成像系统，再打开电脑进入GeneSnap软件。

3．在使用紫外光源照相的过程中，不可以打开凝胶成像系统前面板。

七、思考题

1．关于仪器使用和维护应该有哪些注意事项？

2．通过哪些方面的调整可以使我们采集到的照片的质量更好？

3．如果透射光源分布不均会对分析结果产生什么影响？

4．通过哪些手段可以使我们定量分析的结果更准确？

实验题目：电泳技术                       教    师：赵明智

实验类型：基本技术　                      学　　时：　4　　　　

内　　容：

一、仪器设备  等电聚焦电泳、梯度电泳、纸上电泳、醋酸纤维薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等所需的电泳仪、电泳槽、制胶模具和所需试剂等。

二、仪器结构 

三、原　　理

    电泳就是带电荷的样品在电场力的作用下，以不同的迁移行为而彼此得以分离的方法。根据其载体介质的不同可以分为等电聚焦电泳、梯度电泳、纸上电泳、醋酸纤维薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等。

许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子结构机器所在介质的pH和组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及相对分子质量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速率也有差异。因此，在一定时间内各组分移动的距离也不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。

在电泳的过程种药品会受到电场力、分子筛作用、静电吸附作用、共价结合作用等等方面的作用力。药品在这些作用力的综合作用下，泳动的速度产生差异，从而将不同的组分分离开来。

电泳的介质不同，则电泳的功能也不大相同，其所最适用的方向也是不一样的，最终检测的指标也是不一样的。等电聚焦电泳常用于测定蛋白质的等电点，他最后测定的指标就是pH值。琼脂糖凝胶最常应用于核酸的检测之中，最后是以分子量的大小来衡量电泳结果的。

四、适用范围

a)        主要应用于分离各种有机物（氨基酸、多肽、蛋白质、酶、脂类、核苷、核苷酸、核酸等）。

b)        可用于分析物质的纯度。

c)        用于测定相对分子量。

d)        与层析连用可用于蛋白质结构分析。

五、操作步骤

1．配制胶并且将电泳装置连接好。

2．点样，点样量大小要合适。

3．选择合适的电压进行电泳。

4．染色或者处理凝胶，检验电泳结果。

六、注意事项

1．要选择合适的点样量。

2．选择合适的电压或者电流，并设定合适的程序。

七、思考题

1．电泳结果不好可能有哪些方面的原因？

电泳时的电压根据什么作出选择的？

实验题目： 高效液相色谱技术                                 教    师：孟庆繁

 实验类型： 基本技术    　                                   学    时：6                        

内    容：

一、             仪器设备

HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。

                        图1  高效液相装置图

二、             仪器结构

1．2487双通道紫外检测器：

                 图1  2487检测器外观

                          图2  2487的显示屏

图3  2487的控制面板

2．Waters600色谱泵

                  图4  600泵的控制面板

三、             原    理

色谱法的分离原理是：溶于流动相（mobile phase）中的各组分经过流动相时，由于与固定相（stationary phase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在流动相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

四、             使用范围

高效液相色谱法适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80%。其余20%的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。

五、             操作步骤

1． 600泵的操作步骤：

a.  600泵的启动

600泵接通电源后，首先运行自检程序，通过自检后，显示初始屏幕。初始屏幕显示：型号，版本号等，并显示下一步操作的提示键。

*开机顺序

检查600泵的电路，流路和氦气已按要求正确连接。

确认氦气减压表在50－90psi间。

接通电源。

通过自检后，氦气脱气操作。

按setup键，进入设置窗口

移动光标至流动相脱气区（瓶号：ABCD）

按1键和enter键，打开相应流动相瓶号的氦气开关

在此窗口中还可设置温度和压力上下限范围

移动光标至相应操作区，用数字键输入数值，按回车键确认

按direct键，进入isocratic窗口

移动光标至氦气流速sparge区

按数字键输入数值,并以enter键确认。

刚开始时通常以100ml/min, 脱气15 分钟。平衡后，可根据流动相的不同而降低氦气流速。

*抽液操作

移动光标键至组分区new composition

在A下方，键入100，enter键

其他组分（BCD）下方键入0，enter键

将抽液阀inlet manifold valve旋至draw位

用针筒抽A液10ml，将抽液阀旋至run位

重复以上操作分别抽取B，C，D液10ml。

*冲洗操作

移动光标键至组分区new composition

在A下方，键入100，enter键

其他组分（BCD）下方键入0，enter键

旋开参比阀reference valve

移动光标键至流速区flow rate

设置流速为10ml/min: 键入10，enter键

将抽液阀旋至draw位用针筒抽液10ml

将抽液阀旋至inject位，并推出针筒中的液体

将抽液阀旋至run位。此时参比阀排出的液体应连续，如不连续则重复以上抽液排液操作。

将流速减小至0.2ml/min

将参比阀关闭。

b.  600泵的实验操作

*等度实验

按direct键，进入isocratic菜单。

依次设定流路配比，氦气流速，柱温。

设定方法如下：

按光标移动键，至闪烁光标出现在所需设定位置上。

用数字键设定数值，按enter键确认。

设定流速为0.1ml/min,设定方法同前

逐渐增加流速至实验所需的流量。

待系统平衡后开始实验。

*梯度实验

设定梯度表

 按program method键，进入梯度编辑窗口。

移动光标键至table #处，输入数字键(1-15)，按enter键

将光标移至梯度表第一行，依次输入流速和流量配比，分别按enter键确认

光标移至第二行，依次输入梯度时间，流速，配比及曲线号(1-11)

重复以上操作，至梯度表全部编完

按显示屏对应功能键save，并记住table #

设定事件表(option)

  按program table键，进入编辑菜单

移动光标键至table #处，输入数字键(1-15)，按enter键

将光标移至事件表第一行，依次输入事件号(1-10)和开关，按enter键确认

光标移至第二行，依次输入事件时间，事件号，和开关，按enter键确认

重复以上过程至事件表完成

按save键储存。

运行梯度表

   按operate methods键，进入梯度方法运行窗口

将光标移至table处，输入欲运行的表号(1-15)

    按显示屏对应功能键start run，运行

c.  实验结束

对泵进行冲洗后，关闭流量，注意流速必须要逐步变化。

*冲洗顺序

   如果使用有缓冲液的流动相，则停泵前一定要用HPLC级纯水清洗HPLC系统。

同时用清水清洗柱塞杆。

    若停泵存放时间超过一天，则停泵前还需用水/甲醇清洗系统。

*关闭电源开关。

2.  2487检测器的操作步骤

a. 开机

  检查2487的电路，流路已正确连接

  如较长时间未用, 开机前用HPLC级甲醇(已经过滤和脱气)用1ml/min 流速冲洗至少15分钟

  接通电源开关

  LCD面板显示一系列自检过程，约7分钟

  通过自检后显示吸光度主屏幕

b. 单/双波长方式的设定

当2487在Stand alone模式下运行时，可通过面板键盘选择其单/双波长检测方式

2487的预设方式是单波长方式,在主屏幕下,按λ／λλ(Shift +Autozero)键可在 单/双波长方式间切换,并被检测器记忆存储,下次开机时,2487会显示上次关机时的设置,主屏幕右侧会出现一个λ或λλ标记,分别表示检测器已处在单或双波长方式下

在主屏幕下可用A/B键切换通道,分别观看A或B通道的吸光度检测值，并可分别键入波长和灵敏度数值,以及其它参数

c. 关灯

为节省灯的使用寿命,可在2487不关机的情况下,只把灯关闭  (Waters 建议:只是在关灯时间超过4小时以上时才需要实施关灯操作,因为频繁开关灯,同样会有损灯的寿命)

按Lamp(Shift,1)键,出现一个灯控制屏幕

再按一次Lamp(Shift,1)键,即将灯关闭,显示屏上会出现灯关闭的信息和图示

d. 关机

关机前需保证流动池内无缓冲盐，用100%水冲洗，以洗去缓冲盐

再用90:10的甲醇/水，冲洗系统，并将系统保存在该流动相中

将面板右下角的电源开关扳到off, 即将2487检测器关闭。

六、             注意事项

1．柱的使用和维护注意事项

  ①　避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。

④       选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。

⑤       避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。

  ⑥　经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。

  ⑦　保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。

  ⑧  每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。

2．泵的使用和维护注意事项                 

为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：

①     防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、 

缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。

  ② 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停

泵过夜或更长时间的情况下。

  ③ 泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。

  ④ 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。

  ⑤ 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。

七、             思考题

1． 色谱分析的基本原理是什么？

2． 何谓流动相，固定相？

3． 任何样品都能用液相色谱法分析吗？

实验题目：消毒、灭菌与无菌操作技术                      教  师：王彦峰                       

实验类型：基本技术                                      学  时：6                         

内    容：

一、仪器设备

手提式高压灭菌锅、立式高压灭菌锅、全自动高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、无菌室、酒精灯  滤菌过滤器

二、仪器结构

  灭菌器：安全阀 压力表  放气阀 软管 紧固螺栓 灭菌桶 筛架 水（各种型号的结构有些不同，但是原理是一样的）

  超净工作台：开关 风力调节器 灯开关

  烘箱：电源开关  设温旋钮  显示屏

三、原理

1.      干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的

2.      湿热灭菌是物品放入密闭的加压灭菌锅内加热，产生蒸汽，排除冷空气后密闭，使蒸汽不溢出，

增大压强，使水的沸点升高，高于100℃，导致菌体蛋白质凝固变性达到目的

3.      过滤除菌主要是选用孔径小的微孔材料制作成专门的细菌滤器，通过减压过滤，达到除菌。

4.      紫外线灭菌是指在波长200nm-300nm之间，紫外线诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交

联，从而抑制了DNA的复制达到灭菌。另外，由于辐射使空气中的氧电离成氧离子，氧离子再把氧气氧化成臭氧或使水被氧化为双氧水，臭氧和双氧水都有杀菌的作用。

      5.  化学药品灭菌是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的。

四、适用范围

适用于任何无菌操作的实验。如：细胞传代培养、植物组织培养、细菌接种、微生物的分离纯化等各种高压蒸汽灭菌、干热灭菌、紫外线灭菌的原理和操作技术；无菌室、超净工作台的使用和在酒精灯火焰旁接种技术

五、操作步骤

各种高压蒸汽灭菌、干热灭菌、紫外线灭菌的原理和操作技术；无菌室、超净工作台的使用和在酒精灯火焰旁接种技术

六、注意事项

高压蒸汽灭菌开始前要把冷空气排尽，灭菌后要待压力降到“0”时才打开排气阀；烘箱灭菌要注意被灭菌物的灭菌温度；紫外线灭菌不要让紫外线照射人的皮肤；无菌室要定期用甲醛蒸汽熏蒸

七、思考题

1.为什么灭菌器内需要灭菌的物品不能摆的太密？

2.干燥箱灭菌的温度是多少？灭菌结束后要注意什么？

3.比较干燥箱灭菌和高压灭菌器灭菌的优缺点，并说出原因。

实验题目：培养技术                                    教    师：王彦峰                       

实验类型：基本技术                                    学    时：4        

     内    容：

一、仪器设备

恒温培养箱、光照培养箱、CO2培养箱、气浴恒温振荡器、水浴恒温振荡器、全自动发酵罐

二、仪器结构

   培养箱：电源开关 设温旋钮 显示屏（各种型号有所不同）

   光照培养箱：电源开关 设温旋钮 光照旋纽 程序调节旋纽 显示屏

   水浴、气浴振荡器：电源开关 设温旋钮 转速调节旋钮 显示屏

三、原理

   培养箱可以维持恒定的温度，光照培养箱可以按照程序循环来模拟气候变化，气浴和水浴可以调节转速，使培养在液体培养基中的微生物或细胞生长。

四、适用范围

适用于任何需要恒温、变温的培养。如微生物分离、纯化、培养，动物细胞传代培养等。

五、操作步骤

恒温培养箱、光照培养箱、CO2培养箱、气浴恒温振荡器、水浴恒温振荡器、全自动发酵罐等结构及使用方法。

六、注意事项

培养时控制好温度，光照培养箱还要控制好光照强度、湿度；培养细胞及微生物时要无菌操作；水

浴振荡器使用前必需加水，使用过程中要检查是否有水。

七、思考题

1.使用培养箱时应注意什么？

2.二氧化碳培养箱的使用注意事项是什么？

3.全自动发酵罐的工作原理是什么？使用时应注意哪些方面。

实验题目：生物切片技术　　　　　　　　　　　　　　教   师：申斯乐                   

实验类型：基本技术                                 学   时： 4                

内    容：

一、实验目的

掌握徒手切片技术；熟悉在显微镜下植物组织结构的观察

二、实验原理

    徒手切片法是用手直接握住小刀片，把选用的待观察的生物组织或器官切成薄片，以便于在显微镜下观察。该制片法简单易行，可及时观察到活体组织的结构与颜色。实验教学中，通常选用的植物材料作形态解剖观察时，适于以徒手切片法将组织制成玻片标本。待手切片的局限性在于难以把过干硬或柔软的材料制成薄片，对需制作连续切片厚度在几个微米的要求时，徒手切片更是无能为力。

    三、试剂与器材

      　烧杯、盖玻片、载玻片、解剖针、刀片、毛笔、显微镜等

    四、实验内容

取材→切片→选片→固定与染色→脱水→透明→封片

     五、关键步骤与注意事项

1.切片时，切片和材料上都应不时地沾上水；动作要均匀有力，一刀切下，不得拉割或中途停顿。

2. 封片时，载玻片、盖玻片必须清洗干净；树胶滴加要适量，以盖玻片盖上时树胶刚好扩散至其边缘为宜；树胶浓度也要适当，要既有一定的粘稠度又不能过于浓，可以在盖玻片下缓缓散开为宜。

     六、思考题

    　 1．徒手切片显微镜观察的关键步骤是什么?

2．在徒手切片时要注意哪些事项?

实验题目：PCR技术                         教    师：逯家辉

实验类型：基本技术　                        学　　时：　　2　　　

内　　容：

七、        仪器设备：PCR仪

八、        仪器结构：

九、        原　　理：

1、PCR技术的基本原理：

　  PCR的最大特点是其扩增产物的特异性、扩增效率的灵敏性、扩增程序的简便性。引物序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。通过人工合成的特异性引物和Taq DNA 聚合酶，从模板DNA中扩增出所需的DNA片段。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

2、PCR的反应动力学：

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

3、  PCR扩增产物

可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析。

十、        适用范围

1、从基因组中调取特定基因

2、mRNA逆转录制备cDNA

3、基因定点突变

4、DNA片段加入粘性末端

5、核酸中引入特定酶切位点

6、核酸测序

7、cDNA3’或5’末端的快速扩增

十一、             操作步骤

主要通过选择键“< >”来确定执行的功能,用“PROCEED”输入所设定的各种参数，用“CANCEL”，取消输入或退回到前一步程序。以后各操作均如此，不再重复叙述。

    (1)运行程序

    当开机自检后仪器进入初始状态，显示如下：

    -Run    Enter    

    -Program Program 

按PROEEED键，则显示如下：

    Run 

    Quickstep ? 

通过选择键“< >”，RUN下方显示的程序名称不断变化，可选择运行仪器内已存在的程序名称，此时再按“PROCEED”显示如下：

Enable      Disable

Heat bannet

    选择ENABLE就是使用热盖，选择DISABLE就不使用。选择后，此时再按“PROCEED”，程序开始运行。

（2）编写新程序

    本仪器在出厂前已含有14个程序，具体名称和程序见原厂说明书，在具体使用时，操作人员可按需要编写程序，输入后会自动贮存，关机后可长期保留，本仪器贮存80个程序，每个程序最多可编100步9999个循环。

    开机进入初始状态后，选择ENTER PROGRAM，此时显示：

         Name      A

    这是让操作人员输入程序的名称，通过选择键“< >”，可选用各种字母、字符来组成程序名，选好字符后按“PROCEED”输入在光标向右移动，这时可输入程序名的下一个字符，程序名最多由8位字符组成。在最后一个程序名字的字符输入后连续2次按PROCEED，则程序名字输入完毕。程序名字输入后显示：

     Step1               -TEMP

     Goto     Option     End

此时可选择编程每步所要进行的操作，用“<>”选择，然后按“PROCEED”输入。

①设定温度和时间（TEMP）

可设定温度范围从-4度至105度，时间从1秒至99小时59分59秒之间或无限长。输入温度时可显示：

Step1        Hrs

Min          Sec

这时输入设定温度的持续时间。若某项时间为“0”，可直接按“PROCEED”输入时间后，按“PROCEED”键，则显示：

Step2           一TEMP

    Goto    Option    End

这时可以进行第2步的编程，选择相应的操作。

②设定循环程序(GOTO)

    选择“GOTO'’后，显示为：

    Step4    -

    Go to step_

这时可以设定程序从哪一步循环，例如转到第2步开始循环，则在GO TO STEP后输入“2”，显示为：

    Step4      Go to 2

    _more times 

这时可以输入循环的次数，如需从第1步到第3步循环30次，则输入29，循环结束后进入下一步。

    ③设定其他功能(OPTION)

    编程时选择OPTION后出现3个附属功能Extend，Increment和Slope，是用于循环程序时，每一次循环按一定的规律进行时间、温度或时间温度的变化。

EXTEND，是用于时间延伸，负值为时间的缩短，例如：

    Step5  

    Temperature_

开始希望在65度，输入65后则出现：

    Step5

    Min_    Sec

这时可输入初始的保留时间，例如40秒，则按“PROCEED”后，显示变为：

    Step5

    Extend    —s／cyc

这时可输入每次循环的时何变化率，如“2”，即保留时间从初始的40秒开始经每次循环增加2秒。

INCREMENT：与上述原理相同，只不过是温度的变化。

SLOPE：为循环时间和温度同时变化。

    ④设定程序结束(END)

    每一个程序的设定最后一步必须由“END”来完成，用选择键选“END'’后显示：

    Step#          Temp

    Goto  Option   END

这时按“PROCEED'’输入最后一步“END”。再按一次“PROCEED”。确认该程序已编写结束，这时已自动贮存在仪器内，程序运行到最后一步即END时，仪器停止加热或降温，并显示“COMPLETE"。基座将回到室温状态。

    (3)列出程序(LIST)

    可以观察仪器内存有的任何程序的全部内容，在初始状态下，选择ENTER PROGRAM后选LIST，变为：

    List    

    Quick step?

这时可选择所要列出的程序内容的程序名称，如选“Quickstep”，按PROCEED后，会显示程序的内容，格式如下：

    program    step    block

    Quickstep    1    94℃

    00：00：05

    cycle time    sample

由上图可知QUICKSTEP这个程序的第一步是设定温度在94度保留5秒，用“<>”可变换显示每一步程序内容。显示最后一步“END'’，再按一次“>”则回到初始显示状态。LIST只是列出程序内容以供观察参考，不能改变程序各项值。

    (4)修改程序(EDIT)

    正在编写新程序时，若输入值有误，在未按“PROCEED”时只要按CANCEL即可回到原参数位置重新修改．输入新值即可，若已经按“PROCEED'’输人程序，需要修改参数时则连续按CANCEL，直到显示回到这一步的原始状态。

    对于修改以前存在的程序，则是在仪器初始状态下选择ENTER PROGRAM，然后选择EDIT，按PROCEED后显示：

    Edit

    Quickstep?

    这时可以用“< >”选择键来选择所要修改的程序名称，找到后按PROCEED，这时会出现程序的内容，如：

    Quickstep    l    94℃

             00：00：05

用“< >”移动光标到所要修改的内下，输入新参数，按“<>”转换程序内容以便作另外的修改，继续按“>”直到退回初始状态，修改即告完成。

    (5)删除程序(DELETE)