限制性内切酶2

四、DNA末端长度对限制酶切割的影响
    限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。
    用20单位（Units）限制酶切割1mg标记的寡核苷酸做测试时，发现不同的酶对识别序列两端的长度有不同的要求（表2-4）。相对来说，EcoRⅠ对两端的序列长度要求较小，在识别序列外侧有一个碱基对时在2小时的切割活性可达90%。而AccⅠ和HindⅢ对两端的序列长度要求较大。

    用DNA片段（线性载体）检测末端长度对切割的影响时，同样发现识别序列的末端长度对酶切效率有明显影响，不同的酶对末端长度的要求是不同。
    在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。另外，了解末端长度对切割的影响还可帮助在双酶切多克隆位点时选择酶切秩序。

五、位点偏爱（Site preference）
    某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。
    某些噬菌体DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性是不同。λ噬菌体DNA为48502bp，含12bp粘端。EcoRⅠ酶切割l噬菌体中的5个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍；EcoRⅠ对腺病毒2（adenvirus-2）DNA不同位置切点的切割速率也不同。EcoRⅠ和HindⅢ在l噬菌体DNA中的切割速率分别有10倍和14倍的差异。l噬菌体DNA有4个SacⅡ位点，三个在中央，一个在右臂，对中央三个位点的酶切速度快50倍。在 φX174噬菌体（单链环状，5386bp，DNA复制时可以双链形式存在） DNA中发现HgaⅠ切割某些位点比其它的快。在腺病毒2中，CTCGAG位点对PaeR7Ⅰ完全抵抗，但同裂酶XhoⅠ却很易切割，原因是5'末端有一个CT二核苷酸，与甲基化完全无关。
    造成上述现象的原因有以下几种情况。NarⅠ，NaeⅠ和SacⅡ三种酶属于在切割DNA之前需要同时与两个识别位点作用的一类酶。BspMⅠ、EcoRⅡ和HpaⅡ则属另一种情况，它们对要求作用的DNA序列上有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA切割激活另一个的变构位点（allosteric）。这两序列可由顺式（cis）方式提供，即相互靠近或形成环（loop）；或由反式（trans）方式提供，其变构位点由含识别序列的寡核苷酸提供。

六、酶切反应条件
1．缓冲液
    常规缓冲液一般包括提供稳定pH值的缓冲剂、Mg⁺⁺、DTT（二硫苏糖醇）以及BSA（小牛血请白蛋白）。
    pH经常为7.0-7.9（在25℃ 时），用Tris-HCl或乙酸调节；Mg++作为酶的活性中心，由MgCl₂和MgAc提供；浓度常为10mM；DTT浓度常为1mM。有时缓冲液中还要加入100mg/ml BSA，但只是少数反应需要。不同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次将限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低三种类型，离子强度以NaCl来满足，浓度分别为100mM、50mM和0mM。
    要对DNA进行双酶切时，如何选择缓冲液是相当重要的。一方面可选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；若找不到共用的缓冲液则先用低浓度的，再加适量NaCl和第二种酶；或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液（DNA可纯化或不纯化）。
2．反应温度
    反应温度大多数为37℃ ，一部分为50-65℃ ，少数25-30℃ 。高温作用酶在37℃ 下的活性会下降，多数仅为最适条件下的10-50%。如Taq限制酶（正常反应温度为65℃），在37℃ 只有在65℃ 活性的10%；ApoⅠ（正常反应温度为50℃），37℃ 只有在50℃ 时活性的50%。销售商在产品说明中都会标明最佳反应温度。
3．反应时间
   反应时间通常为1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。EcoRⅠ若反应16小时，所需酶量为正常酶切