实验知识

实验题目：线粒体、液泡系的活体染色            　    教  师：申斯乐                       

实验类型：基础           　  学   时： 4            学  分：0.12

内    容：

一、实验目的

活体染色是细胞器活体观察的一种重要手段，常见有中性红染液泡系、Janus green B染线粒体。通过本实验学会活体染色的方法。

二、实验原理

    活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

    根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体染色分为体内活染和体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

    活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，他们彼此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，Janus green B和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。

三、试剂与器材

 1.材料 小白鼠肝细胞  人口腔上皮细胞  洋葱鳞茎内表皮细胞  小麦或黄豆幼根根尖

 2.试剂 Ringer溶液  10%、1/3000中性红溶液  1%、1/5000Janus green B溶液

 3.实验器材 显微镜 载片 盖片 刀片 吸水纸镜头纸 恒温水浴锅 解剖盘 剪刀 表面皿牙签 凹面载玻片

四、实验内容

动、植物活细胞→中性红染10分钟→吸干染料→换上Ringer氏液→制片观察。

     动、植物活细胞→Janus green B染30分钟→吸干染料→换Ringer氏

液→制片观察。

     五、关键步骤及注意事项

  1. 注意Janus green B染色时，应让组织露在空气中以保持呼吸正常。

六、思考题

1.      用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为什么不能同时观察到线粒

体、液泡系等多种细胞器？

2.      小麦或黄豆根尖经中性红超活染色，为什么看到生长点的细胞中液泡

多，而且染色深，延长区细胞中液泡数量变少，染色浅？

实验题目：DNA的Feulgen反应                          教   师：申斯乐                       

实验类型：基础           学    时： 4                 学   分：0.12

内    容：

一、实验目的

Feulgen 反应是专一性染DNA的反应，是经典的细胞化学方法，通过实验使学生掌握Feulgen染色的技术。

二、实验原理

    DNA经弱酸（1mol/LHCL）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明了Feulgen反应的专一性。

三、试剂与器材

 1.材料 Carnoy液固定的鼠肝石蜡切片  Carnoy液固定的洋葱根尖或蚕豆根尖切片

 2.试剂 Carnoy固定液  1mol/LHCL  Schiff试剂  亚硫酸水溶液  5%三氯乙酸  0.5%固绿酒精溶液

 3.实验器材 显微镜 载片 盖片 刀片 吸水纸镜头纸 恒温水浴锅  剪刀 表面皿  凹面载玻片

四、实验内容

兔肝石蜡切片（洋葱根尖石蜡切片）→脱蜡→复水→1mol/L HCl水解（60℃）→Schiff试剂染色避光→分色→亮绿复染→显微镜下观察  

  五、关键步骤及注意事项

1. Schift试剂的配置；掌握好HCl水解的时间；Schift试剂染色时注意遮光。

六、思考题

1.      说明Feulgen 反应中设立的对照组的必要性。

2.      简图表示Feulgen 反应的染色结果。

实验题目：细胞内多糖的PAS反应                         教  师：申斯乐                       

实验类型：基础              学    时： 4                学  分：0.12

内    容：

一、实验目的

过碘酸雪夫反应是经典的细胞内多糖物质的染色方法，通过本实验使学

生掌握细胞内多糖的染色方法。

二、实验原理

   过碘酸将糖链打开，产生的游离的醛基与碱性品红结合，是多糖呈红色，染色部分即为细胞内多糖。

三、试剂与器材

 1.材料 马铃薯  红薯

 2.试剂 Schiff试剂  亚硫酸水溶液  70%乙醇  过碘酸

3.实验器材 显微镜 载玻片 盖玻片 刀片 吸水纸 镜头纸 恒温水浴锅 

四、实验内容

徒手切片→滴一滴过碘酸→70%乙醇→Schiff试剂避光→亚硫酸水洗3次→流水冲洗→盖上盖玻片→显微镜下观察  

  五、关键步骤及注意事项

1. 如染糖元，注意材料制备过程中不要接触水（而以酒精代替）。注意过碘

酸反应的时间。

六、思考题

1.对比实验结果说明两组数据有什么不同？为什么？

实验题目：细胞器的分离与鉴定                           教   师：申斯乐                       

实验类型：综合               学    时： 4              学   分：0.12

内    容

一、实验目的

了解细胞器分离的基本原理，掌握操作方法

二、实验原理

   组织经过匀浆化后，放在均匀的悬浮介质上，即可用差速离心法分离其亚细胞组分。

   球形颗粒在均匀的悬浮介质中的沉降速度取决于离心场G、颗粒的密度、半径以及悬浮介质的粘度。

   细胞器分离常用介质是缓冲的蔗糖水溶液。它比较近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在pH7.4的条件下细胞器不易发生聚集。

三、试剂与器材

 1.材料 大鼠肝脏

 2.试剂 生理盐水  0.25mol/L蔗糖—0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4）  0.34mol/L蔗糖—0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4）  0.34mol/L蔗糖—0.05mol/LMg（AC）2（pH7.4）  0.88mol/L蔗糖—0.05mol/LMg（AC）2（pH7.4）  RSB溶液  1%Janus green B溶液  甲基绿-派洛宁染液  Carnoy固定液  丙酮  蔗糖溶液  酸性磷酸酶显示用液  酸性磷酸酶作用液  葡萄糖-6-磷酸酶显示试剂 

 3.实验器材 解剖刀剪 漏斗 玻璃匀浆器 尼龙织物温度计 离心管 冷冻高速离心机 显微镜载片 盖片 刀片 吸水纸 镜头纸 恒温水浴锅  冰箱 恒温培养箱

四、实验内容

取动物肝脏→匀浆→差速离心→分离细胞核→收集质膜→细胞核纯化→分离线粒体→分离溶酶体→分离物鉴定。 

五、关键步骤及注意事项

1. 注意掌握差速离心的时间和速度，注意低温操作，匀浆时充分破碎组织时间不宜过长。

六、思考题

1.差速离心与密度剃梯度离心方法有什么不同？离心结束时亚细胞组分在

介质中各呈什么样的分布？因而收集组分的方法有什么分别？

实验题目：植物组织及细胞培养                            教  师：申斯乐                       

实验类型：综合              学    时：26                 学  分：0.76

内    容：

一、实验目的

掌握植物组织培养技术，了解不同激素及其比例对愈伤组织再分化的作用。

二、实验原理

   在适宜的条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生完成植株。

三、试剂与器材

 1.材料 枸杞、烟草等植物的叶片

 2.试剂 70%乙醇 0.1%升汞 硝酸钾 硝酸氨  七水硫酸镁  磷酸二氢钾  二水氯化钙  四水硫酸锰  七水硫酸锌  硼酸  碘化钾  二水钼酸钠  五水硫酸铜  六水氯化钴  六水硫酸亚铁  甘氨酸  烟酸等

 3.实验器材 镊子 解剖刀剪 接种针 铝饭盒恒温培养箱 锡箔纸 记号笔 橡皮筋 试剂瓶三角瓶 移液管 培养皿  酒精灯  超净工作台  灭菌锅  显微镜

四、实验内容

配制培养基→培养基灭菌→材料消毒→接种→培养、观察→愈伤组织分化

五、关键步骤及注意事项

1. 实验器材、材料及操作均需严格无菌。在培养过程中也要经常检查，剔除被污染的三角烧瓶。

六、思考题

1.      根据枸杞叶片培养过程中所看到的结果，你认为2，4-D、6-BA和NAA

对于形态发生过程各有何影响？

2.      人工条件下培养的植物离体器官、组织或细胞，经过分裂、增殖、分化、

发育，最终长成完整的植株的过程，能够说明什么问题？

实验题目：动物细胞培养                                  教  师：费晓方                       

实验类型：综合              学    时：26                学  分：0.76

内    容：

一、实验目的

通过本实验了解原代细胞与传代细胞培养的基本方法以及在细胞培养过程中严格的操作程序。

初步掌握无菌操作的基本原则，认识无菌操作在细胞培养中的重要性。

二、实验原理

  原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官）经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外生长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌操作。

三、试剂与器材

 1.材料 出生后2-3天的乳鼠

 2.试剂 平衡盐液－Hank液  细胞消化液  0.5%水解乳蛋白-Hank液  犊牛血清  碳酸氢钠 1万单位/ml青、链霉素  3%谷氨酰胺  磷酸盐缓冲液

3.实验器材 镊子 解剖刀剪 眼科剪 眼科镊 纱布块 玻璃漏斗 量筒 记号笔 试管 试剂瓶三角瓶 移液管 培养皿 培养瓶 吸管 橡皮头 显微镜 血细胞计数板 计数器 酒精灯酒精棉球 试管架 试管解剖板 碘酒棉球 口罩 二氧化碳培养箱  超净工作台 灭菌锅  倒置显微镜

四、实验内容

原代培养：取肾→消化分散组织→计数与稀释→分装培养→观察。

传代培养：配置培养液→消化细胞→细胞计数→培养观察。

培养细胞冷冻保存。

五、关键步骤及注意事项

1. 注意无菌操作，及时更换培养液。

六、思考题

1.      简述细胞传代培养的操作程序注意事项？

2.      细胞培养获得成功的关键要素是什么？

3.      简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。

实验题目：原生质体的分离、融合与培养                   教  师：申斯乐                       

实验类型：综合              学    时：4                 学  分：0.12

内    容：

一、实验目的

掌握用聚乙二醇法诱导同种植物原生质体融合技术，并鉴别杂种细胞。

二、实验原理

  不同植物的原生质体可在人工诱导条件下融合。所产生的杂种细胞，即异核体，经过培养可再生新壁，分裂成愈伤组织，进而分化产生杂种植株。由于进行融合的原生质体来自体细胞，故该项技术也叫体细胞杂交。原生质体融合能使有性杂交不亲合的植物物种间进行广泛的遗传重组，因而在农业育种上具有巨大的潜力。在植物遗传操作研究中也是关键技术之一。

三、试剂与器材

 1.材料 烟草或其它植物无菌苗的叶片   胡萝卜肉质根诱导的松软愈伤组织或悬浮培养细胞

 2.试剂 酶液及洗涤液  PEG液  高pH高钙稀释液  DPD培养基

3.实验器材镊子解剖刀剪 接种针 铝饭盒 恒温培养箱 锡箔纸 记号笔 橡皮筋 试剂瓶 三角瓶移液管 培养皿  酒精灯  超净工作台  灭菌锅  倒置显微镜

四、实验内容

原生质体分离、收集→将两种原生质体等量混合→在培养皿底形成一层→加入聚乙二醇→加入稀释液→吸去→再加入→用DPD培养基换洗二次→平皿中加培养基26℃下暗培养→弱光下培养→观察融合。

五、关键步骤及注意事项

1. 清洗时注意勿使原生质体浮起。

六、思考题

1.说明影响细胞融合成功的因素有哪些？

实验题目：原生质体诱变选育冬虫夏草优良菌种           教   师：滕利荣                       

实验类型：设计              学    时：10               学   分：0.3

内    容：

一、实验目的

掌握用工具酶制备原生质体的技术，并采用诱变的方法筛选出高产菌株。掌握原生质体的分离、培养方法，并对分离结果进行观察。

二、实验原理

    处在一定生长时期内的冬虫夏草菌丝体细胞壁，易被复合酶降解。由此能够制备大量冬虫夏草原生质体。原生质体因为缺乏细胞壁的保护，容易受诱变剂NTG的作用，从而产生大量的变异菌株。通过对这些变异菌株进行筛选，得到高产菌株。

三、试剂与器材

 1.材料 Cordyceps militaris菌种

 2.试剂  溶菌酶 纤维素酶 蜗牛酶  马铃薯培养基（PDA）渗透压稳定剂 NTG溶液

 3.实验器材 镊子接种针 血球计数板 试剂瓶 三角瓶 移液管 具塞小试管 培养皿  酒精灯  超净工作台  灭菌锅  倒置显微镜  电子天平 摇床恒温培养箱 高速离心机 真空冻干机

四、实验内容

原生质体制备条件探索（复合酶组合及用量、酶作用时间、渗透压稳定剂、最适菌龄）→得出制备冬虫夏草原生质体的最佳条件组合→大量制备原生质体→800r/min离心2min去残余的菌丝碎片→3000r/min离心10min弃上清→渗透压稳定剂洗涤→离心两次悬于渗透压稳定剂→血球计数板计数→采用不同浓度的NTG溶液和不同作用时间组合诱变→诱变后的3000r/min离心10min→渗透压稳定剂洗2次→悬于渗透压稳定剂→加入到100ml/250ml的再生液体培养基中再生→吸取少量菌悬液涂布平板→培养2天后挑取单菌落→液体培养基中扩大培养→将培养5天的菌悬液4000r/min离心15min收集菌丝体→冻干→测甘露醇含量。

五、关键步骤及注意事项

1. 清洗时注意勿使原生质体浮起。无菌操作。

六、思考题

1.怎么保证所筛选高产菌株的特性稳定遗传？

2.本设计试验的有什么实际应用意义？

实验题目：大豆肽的分离纯化及活性测定                 教   师：王国彦

实验类型：设计　            学　　时：　50　　　   　 学　 分：1.47

内　　容：

一、实验目的 （1）掌握蛋白质的分级提取和制备丙酮干粉的技术；

（2）学习Folin-酚法测定蛋白质浓度的原理和方法；

（3）掌握标准曲线的制作方法和注意事项；

（4）掌握分光光度计的原理、使用方法和注意事项

（5）学习微量凯氏定氮法的原理和操作技术

             （6）通过双向纸层析，测定大豆蛋白的氨基酸组成，掌握分离层析的原理、氨基酸纸上层析法的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量）。

二、实验原理   大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。

三、试剂与器材  分析天平、分光光度计、离心机、恒温水浴、真空干燥器、 凯氏烧瓶、改良式凯氏蒸馏仪、锥形瓶、微量滴定管、水解管、鼓风恒温箱、水浴锅、吹风机、玻璃喷雾器、层析缸等。

四、操作方法

① 对大豆粉进行水、碱两步提取；

② 制作Folin-酚法测定蛋白浓度的标准曲线；

③ 测定两步提取液的蛋白浓度（Folin-酚法）；

④ 将提取的大豆蛋白制成丙酮干粉。

⑤ 用微量凯氏定氮法测定提取的大豆蛋白质含量：

样品→消化→蒸馏→滴定→计算

⑥ 双向纸层析测定大豆蛋白的氨基酸组成：

样品处理（水解）→点样→酸性层析液中展层→碱性层析液中展层→显色→ 定性鉴定。

五、关键步骤与注意事项

① 提取蛋白等电点沉淀时pH值的调节。

② Folin甲、乙试剂的使用条件和干扰因素；

③ 小心加样，切勿使样品沾污凯氏烧瓶口部、颈部。

④ 消化时，需斜放凯氏烧瓶（45o），火力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上，以致影响测定结果。

⑤ 蒸馏时，切忌火力不稳，否则将发生倒吸现象。 

⑥ 样品水解温度保持105度，使样品水解完全。

⑦ 层析液中的酸或碱的含量必须足够，而且在展层前必须用酸性层

析液和氨水分别进行饱和，以防止层析滤纸上酸碱度不足的现象。

六、思考题

1、采用Folin的酚法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？

2、作为标准蛋白的牛血清白蛋白在应用时有何要求。

实验题目：蔗糖酶的N-末端氨基酸测定                   教  师：周杰

实验类型：基础　            学　　时：　8　　　　  　学　分：0.24

内　　容：

一、实验目的  掌握FDNB法测定蛋白质N-末端氨基酸的原理和方法。

二、实验原理  FDNB与蛋白质在室温，pH=8.0—9.0条件下反应，生成DNP—蛋白；随之，在105℃，6mol/LHCl条件下水解，生成DNP—氨基酸及其它游离氨基酸。由于DNP—氨基酸溶于乙醚，而其余氨基酸不溶，故用乙醚抽提出DNP—氨基酸，再将未知样的DNP—氨基酸与已知标准DNP—氨基酸共同进行纸层析，根据Rf值即可推断未知样N末端为何种氨基酸。

三、试剂与器材  •锥形瓶•25—50ml分液漏斗•层析缸•离心机•黑纸•水解管•层析纸•毛细管 •离心管•培养皿(1)10%碳酸氢钠溶液（2）1mol/L氢氧化钠溶液（3）5%FDNB乙醇溶液 （4）浓盐酸（优级纯）（5）乙醚的处理： （6）乙醇（7）1.6mol/L， pH=6.0的磷酸盐缓冲液。（8）6 mol/L 盐酸

四、操作方法  DNP—蛋白的制备、DNP—蛋白水解、DNP—氨基酸的抽提、DNP—氨基酸的鉴定、计算迁移率Rf值

五、关键步骤与注意事项

1、由于反应期间有二氧化碳和氟化氢气体生成，因此，在振摇期间应间隔放气，以免反应液随气体冲出，腐蚀皮肤，且放气时管口不要对着别人。

2、反应过程中应注意溶液pH值的变化，使其保持在pH8.0-9.0，若低于此范围，应用1mol/L氢氧化钠溶液调整，注意pH值不可过高，若pH超过9，则易使FDNB分解成二硝基苯酚（DNP—OH）。

3、由于加入盐酸后，会有大量的二氧化碳气体产生，因此在加完每一滴盐酸，待反应产生的气体消除后，再加入第二滴，防止气泡冲出管外。

4、以下步骤，均取血红蛋白单独操作。※ 每次洗涤液不必太多，以免离心时冲出，只需将沉淀浸没即可。

5、最后一次醚洗涤后，弃去上清，不断搅拌沉淀直至黄色干粉状（此时可打开管上的胶布和黑纸）。此步一定要不断搅拌，使乙醚很快蒸发，否则DNP—蛋白会结成硬块，不易水解完全。

6、水解管封管时，应先将管内的冷空气赶尽，否则在烘箱内加热时会膨胀引起管炸裂。

7、水解时间的长短与蛋白质及其N—末端氨基酸的种类不同而异。

8、水的用量不宜过多，以免DNP—丝氨酸或DNP—苏氨酸部分溶于水层，造成损失，醚层中含有醚溶性DNP—氨基酸。

9、DNP—组基酸和DNP—精基酸是水溶性的，不能被乙醚抽提，而留在水相。若怀疑蛋白或肽的N—末端氨基酸是组氨酸或精氨酸时，则应将水层在60℃水浴上蒸干，再加入1ml蒸馏水，蒸干，反复两次以除去盐酸，再进行鉴定。

10、点样时不能太靠纸的边缘，以免溶剂效应，使点扩散，样品相隔也不要太近，以免互相重叠，丙酮加入量不要太多，以免浓度太低，走出的斑点颜色淡，但浓度过大，则易形成拖尾。

※

六、思考题

1、分析和鉴定 DNP—氨基酸采用什么方法？为什么采用此方法？

2、盐酸、乙醚、乙醇及水洗的作用是什么？

实验题目：蔗糖酶分子量的检测——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法       教  师：周杰

实验类型：基础　             学　　时：8　　　         学  分：0.24

内　　容：

一、实验目的    学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。

掌握垂直板电泳的操作方法。

运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。

二、实验原理    聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量（有浓缩样品特点，可分次加样；不需解离亚基，适宜测定球蛋白，而对纤维蛋白有误差。电泳需2000伏特小时）

凝胶层析法测定蛋白质相对分子量（特点方法简单，样品用量少，而且有时不需纯物质，一般不引起生物活性物质的变化。局限性是pH6-8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，蛋白质有可能因变性而偏离。

三、试剂与器材  低分子量标准蛋白试剂盒、30%丙烯酰胺（Acr）、10%过硫酸铵

10%SDS（十二烷基磺酸钠）、、 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液、

0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液 、TEMED（四甲基乙二胺）

样品溶解液、固定液、染色液、脱色液、电极缓冲液

垂直板电泳装、置直流稳压电源、移液管、滤纸、微量注射器、大培养皿

四、操作方法

1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形瓶.

2.把玻璃板在灌胶支架上固定好.

3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟.

注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.

4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.

5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖.

6、加样三个。 （1）取10µl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10µl 2倍样品

                   缓冲液，上样量为20µl。

              （2）取10µl样品1溶液，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样

量分别为5µl和10µl。

7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。

8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。

9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。

10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。

绘制标准曲线

以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。

五、关键步骤与注意事项

1、固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.

2、凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.

3、水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡

4、凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.

5、样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.

6、要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.

7、注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散. 

8、为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.

9、剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。

六、思考题

1、在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?

2、电极缓冲液中甘氨酸的作用?

3、在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?

4、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?

实验题目：啤酒酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及米氏常数的测定      教    师：郭慧云

实验类型：综合    　   学　　时：37             学　　分：1.09

内　　容：

一、实验目的（1）了解酶分离提纯的一般原理和步骤

            （2）掌握有机溶剂分级和透析技术

             （3）掌握柱层析的原理和方法

（4）学会3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的原理和操作方法

            （5）了解底物浓度和酶反应速度之间的关系

            （6）掌握测定米氏常数的原理和方法

二、实验原理  l、细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。自溶法的缺点是时间较长。

2、3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理

（1）DNS试剂+ D-葡萄糖           氨基化合物

                        （还原糖）            （棕红色）

（2）在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系（可用于比色测定），所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。

（3）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。

三、试剂与器材  恒温水浴、自动部分收集器、恒温箱、梯度洗脱装置、冰箱、层析柱、分析天平、电磁搅拌器、秒表、离心机、可见分光光度计、冻干机、沸水浴等。3,5二硝基水杨酸试剂(DNS)、5%的蔗糖溶液、1mol/L的 NaOH溶液、乙酸钠、0.2mol/L,pH4.6的醋酸缓冲液 6. 乙酸乙酯

四、操作方法① 细胞破壁→抽提→两次乙醇分级→透析→装柱→洗涤→洗脱→收集酶活力峰→制冻干粉

② 制作3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的标准曲线并测定三种酶样品的活力

③ 测定三种酶样品的蛋白浓度

④ 计算各步酶样的比活力、提纯倍数和收率

            ⑤ 用双倒数作图法测定蔗糖酶的Km值

五、关键步骤与注意事项

① 乙醇分级时，注意低温、防止乙醇局部过浓，离心后要迅速溶解酶样② 装柱均匀，无截面、无气泡，床面平整，柱体垂直

               ③ 分离提纯的全过程中，防止酶失活并用测定酶活力的方法跟踪酶的去向④ 在测定米氏常数时，将酶样溶解后一定要稀释到合适的浓度。⑤ 酶活力测定及作图一定要准确。

六、思考题1、简述蔗糖酶分离提取的原理及操作步骤。

2、3，5-二硝基水杨酸比色定糖法的原理及操作注意事项。

3、用723分光光度计制作工作曲线的要求。

4、蔗糖酶活力测定的原理及两个反应。

5、在酶分离提纯的整个过程中应注意的一个关键问题是什么

实验题目：用正交实验设计法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响  教 师：郭慧云

实验类型：基础             学   时： 10                   学  分：0.29

内容：

一、实验目的 初步掌握用正交表设计实验方案并用数理统计方法处理实验数据

的步骤和注意事项。

二、实验原理  酶的催化作用受多种因素的影响。欲求某因素对酶活力的影响，通常是固定其它因素，测定该因素不同水平下的酶活力。这是将多因素化为单因素处理的简单比较法。

三、试剂与器材 分光光度计、恒温水浴、秒表、沸水浴等。DNS试剂、

pH4.6 0.2ml/L 的醋酸buffer、0.2mol/L蔗糖液、各种pH缓冲液

四、操作方法

① 讲授正交实验设计法的基础知识及使用注意事项

            ② 用正交表进行实验并对实验结果进行极差分析和方差分析

            ③ 求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值

五、关键步骤与注意事项

① 被考察因素以外的实验条件必须保持稳定

            ② 方差分析的计算要用电脑编程

六、思考题

1、设计试验方案时，应遵循的原则是什么？

2、正交试验设计法与简单比较法、全面试验法相比较，有何优缺点？

实验题目：亲和层析法纯化蛋白酶                          教师：刘兰英                       

实验类型：综合               学    时： 34              学分：1

内    容：

     一、实验目的

             学习亲和层析法制备乳酸脱氢同工酶的原理和方法；学习并掌握乳酸脱氢酶同工酶的测定方法 和原理。

     二、实验原理

             利用辅酶及其衍生物、抑制剂或激活剂作为配基，通过“间隔臂”与活化的琼脂糖凝胶载体共价偶联成亲和吸附剂，采用亲和层析法分离乳酸脱氢酶同工酶。

     三、试剂与器材

      1.试剂  5/ -AMP-8(6-氨基己基)胺、QT4、乙腈、溴化氢、碳酸缓冲液、NaCl溶液 、4mol/L及1mol/LNaOH、磷酸氢二钾 — 磷酸二氢钾缓冲液、硫酸铵、尿素、NAD+—丙酮酸钠加成物亲和洗脱液。

      2.器材   玻璃烧结漏斗，pH计、电磁搅拌器、摇床、紫外分光光度计、组织捣碎机、冷冻离心机、层析柱、自动收集器、紫外监测仪、梯度混合器。

     四、实验内容

            1. 5/ -AMP-8(6-氨基己基)氨基Q T4亲和层析介质的制备 （1）配制配基溶液 配200mg 5/ -AMP-8(6-氨基己基)胺的水溶液；（2）预处理QT4  NaCl洗涤，抽滤成饼状；（3） 活化QT4 ；（4）偶联

      2.亲和层析分离LDH（1）制备组织提取液：制备猪骨胳肌及猪心的组织提取液；（2）亲和吸附合并有活力的，测出为吸附的LDH活力；（3）亲和洗脱 留样测活，蛋白质含量计PAGE鉴定；（4）亲和介质的再生与保存

      3.LDH活性测定

      4.蛋白含量测定

      5.PAGE鉴定LDH纯度

     五、关键步骤与注意事项

            测活时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。操作时应注意酶的稀释度及加入量，控制在△A340/min0.1-0.2之间。

 六、思考题

  1.亲和层析法的原理是什么？

  2.分离乳酸脱氢酶同工酶的原理是什么？

  3.如何了解乳酸脱氢酶的活力和纯度？

实验题目：葡萄糖异构酶的固定化及活力测定                教师：刘兰英                       

实验类型：综合               学    时： 8               学分：0.24

内    容：

一、实验目的

    掌握酶的固定化方法及活力测定方法

二、试剂和仪器

       熔砂漏斗、真空水泵、锥形瓶、恒温水浴、分光光度计

   三、实验内容

            载体的制备→酶的固定化→酶与底物的反应→咔唑法测定果糖含量→计算固定化酶的活力

四、关键步骤与注意事项

 1. 对酶进行固定化时要注意缓冲液的pH，离子强度要适宜。

  2. 由于葡萄糖溶液本身有碱异构的现象，所以以葡萄糖溶液为底物测定固定化葡萄糖异构酶的活力时要作空白对照。

五、思考题

  1. 什么是固定化酶？

  2. 进行酶的固定化实验时有哪些要注意的方面？

实验题目：牛乳中蛋白的分离、纯化与鉴定             教   师：刘兰英

实验类型：设计          　 学　　时：20　　　      学　分：0.59

内　　容：

一、实验目的  1 从牛乳中提取酪蛋白，并对其进行纯化。 

              2 鉴定纯化后酪蛋白的纯度及酪蛋白的含量。 

3学习新的实验方法，培养科学的实验作风。

二、实验原理  1 利用酪蛋白在其等电点时（ph=4.8）溶解度最小，使其等电点时沉淀，除去其它蛋白质和脂类，得到粗产品，并利用其不溶于乙醇，初步纯化。  

              2用电泳技术将产品酪蛋白电泳带与标准酪蛋白的电泳带做对比可判断产品是否为酪蛋白。

3 利用SDS-PAGE法和分光光度法鉴定酪蛋白纯度。

4由于酪蛋白在其等电点（PH=4.8）时溶解度最小，又不溶于乙醇，所以可用缓冲液调PH至4.8，用乙醇沉淀此产品。

三、试剂与器材  紫外分光光度计、离心机、水浴锅、电磁搅拌器、自动部分收集器、紫外检测仪、梯度混合器、电泳装置、玻璃仪器等。

四、操作方法  牛乳→醋酸钠缓冲液→离心→洗涤（乙醚、乙醇）→进一步粗提纯→双缩脲（紫外）测定→上柱→SDS电泳

五、关键步骤与注意事项

①    等电点调节准确

②    双缩脲测定含量不能超出曲线范围

③    上柱样量适宜,SDS上样量适宜

六、思考题

  1、在提取细胞色素C的过程中，需注意什么？

2、在装柱的过程中，注意哪些？

实验题目：细胞色素C的制备及含量、活力测定                教    师：郭慧云

实验类型：设计　              学　　时：30　   　　 学　　分：0.88

一、实验目的  （1）通过细胞色序C的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤

（2）掌握制备细胞色素C的操作技术及含量的测定方法

二、实验原理  细胞色素是一类含有铁  啉基团的电子传递蛋白，只存在于需氧细胞中。细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用。细胞色C (cytochrome c) 是细胞色素一种。它在线粒体呼吸链上位于细胞色素B 和细胞色素氧化酶之间，是呼吸链的一个重要组成部分。每分子细胞色素C含有一个血红素和一条多肽链。现已从许多来源获得细胞色素C结晶，并已对100多种细胞色素C蛋白的一级结构进行了测定。结果表明，细胞色素C的氨基酸残基的数目在103~113之间；不同来源细胞色素C的的氨基酸残基的顺序及含量都有一定的差异。细胞色素C中赖氨酸含量较高，等电点为10.7，含铁量为0.38%~0.43%，Mr为12000~13000，猪心细胞色素C分子量12200。细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。细胞色素C分为氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热比较稳定，不易变性。pH 7.2~10.2, 100℃加热3分钟，细胞色素C氧化型和还原型变性程度均为18%~28%，若增加加热时间，氧化型的不可逆变性程度比还原型的为高。细胞色素C对酸碱也较稳定，可抵抗0 .3mol/L氢氧化钾溶液的长时间处理。一般都将细胞色素C制成还原型的，因为比较稳定并易于保存。

三、试剂与器材  绞肉机、电磁搅拌器、离心机、分光光度计、玻璃柱、下口瓶、烧杯等。

四、操作方法材料处理—提取—中和—吸附—洗脱—盐析—沉淀—透析—测定

五、关键步骤与注意事项

① 吸附前必须把人造沸石处理好,装柱时避免柱内出现气泡,沿柱壁缓缓流入柱内。

② 洗脱时洗脱液一旦变白，立刻停止收集。洗脱完毕人造沸石可再生使用。

六、思考题

实验题目：动物基因组DNA、总RNA的提取及含量测定             教   师：滕利荣

实验类型：综合　        学　　时：　16　　　　　学　 分：0.47

内　　容：

一、实验目的  （1） 学习掌握用浓盐法从动物组织中提取核酸的原理和技术；

（2） 学习掌握用定磷法测定核酸含量的原理和方法

              （3） 学习掌握用二苯胺显色法测定DNA含量的原理和方法

二、实验原理  利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA. 强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400μg范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。

三、试剂与器材  台秤、组织捣碎机、医用剪刀、离心机、分析天平、消化装置、分光光度计、恒温水浴、沸水浴等。

四、操作方法  ① DNA的制备

材料处理→提取细胞核→镜检→收集细胞核→提取DNA→收集DNA沉淀→除蛋白→沉淀DNA

② 定磷法测定核酸含量

                   ⅰ 总磷量的测定：核酸样品的溶解→消化→定容→反应→比色测定

                 ⅱ 无机磷量的测定：沉淀→离心→反应→比色测定

                ⅲ 制作定磷法测定核酸含量的标准曲线并测定核酸样品的含量

ⅳ 计算两种核酸样品的含量

               ③ DNA含量的测定

ⅰ 制作用二苯胺显色法测定DNA含量的标准曲线

              ⅱ 测定核酸样品的DNA含量

五、关键步骤与注意事项

① DNA制备的全过程应注意避免大分子DNA的降解和断裂，因此需要注意：

              ⅰ 组织匀浆时不能过于剧烈并防止时间过长，避免细胞核被破坏导致DNA断裂；

ⅱ 除蛋白时，振荡不够会影响DNA的质量，振荡过于剧烈可使部分DNA断裂，因此要掌握好振荡过的温度，同时振荡过程中要不断放气；

ⅲ 在低温下操作，以抑制核酸酶的活力。

② 定磷法测定核酸含量时应注意：

              ⅰ 严格控制核酸用量和酸度,否则影响测定效果

            ⅱ 所有试剂都要用重蒸馏水配置,定磷试剂要当天使用

             ③ DNA含量测定时应注意：

ⅰ 为提高测定准确度，标准DNA要经定磷法确定其纯度

             ⅱ 对配制试剂用的二苯胺要进行重结晶

六、思考题

1.为什么在低温下进行？

2.分别加柠檬酸钠和EDTA的作用  ?

3.加SDS的作用？

4.加NaCL的作用，为什么要加到1mol/L?

5.加入异戊醇有什么作用？

实验题目：动物总RNA的提取及含量测定                  教  师：王国彦

实验类型：综合　            学　　时：　　6      　  学　分：0.18

内　　容：

一、实验目的（1）了解制备RNA几种方法的原理及优缺点

            （2）掌握稀碱法提取兔肝RNA的原理和操作技术

二、实验原理 细胞内大部份RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分离制备RNA时，首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离，并除去蛋白质。由于RNA的种类来源和存在形式不同，所用的制备方法各异，一般常用的方法有，盐酸法，稀碱法和苯酚法。其中，以苯酚法使用较为广泛。产品纯度高，适合小规模生产。动物组织中以肝脏器官RNA含量较为丰富。本实验就是将兔肝组织匀浆，在酚与十二烷基硫酸钠的存在下，RNA与蛋白质分离使蛋白质变性凝固。RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA从水相中沉淀，达到分离。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3， 5-二羟甲苯反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20－250微克范围内，光吸收与RNA浓度 成正比。地衣酚反应特异性较差，凡是戊糖均有此反应。RNA和其他杂质也能给出类似的颜色。

三、试剂与器材 冰箱、恒温水浴、离心机、真空干燥器、煤气灯、冰盐浴等。

0.05mol/L醋酸缓冲液（PH5.0）、25%SDS、80％酚、2mol/L醋酸钠、95％乙醇RNA标准溶液、样品待测液、地衣酚试剂

四、操作方法

1、RNA提取：将新鲜兔肝浸入预冷0度0.05mol/L醋酸钠缓冲液(PH5.0)中,除去肝脏处的结缔组织,除去血凝,用滤纸吸干,称取0.9克.(已称好)

2、 取0.9克肝脏,加入 0.05mol/L醋酸缓冲液(PH5.0)9毫升,250克/升.SDS1.5毫升,移入匀浆管中,匀浆后再加入等体积80%酚,再匀浆一次.

3、 移入三角瓶中,置65度水浴中继续振摇5-8分,取出流水冷却.

4、 离心,3000转/分,10-15分,上层为稍混浊,含有RNA的水相,中层为变性蛋白,下层为酚液,管底残渣,含有RNA.吸出上层水溶液要RNA的收获量,可向中下层液中再加1/2体积的醋酸缓冲液,同样在65度水浴中振摇提取一次,离心后所收得的上层水液,可与上述水液合并,本次实验只提取一次.

5、 用量筒测水液的量,加入1/10体积的2mol/L醋酸钠混匀.再加入2.5倍体积预冷的95%乙醇混匀,冷却放置絮状沉淀充分形成.

6、离心3000转/分,10分钟,倾出上清.

7、沉淀用蒸馏水4毫升溶解,慢慢向沉淀中加入蒸馏水,不断搅拌,