限制性内切酶3
上一篇 / 下一篇 2010-01-21 09:41:00 / 个人分类：分生技术
反应时间通常为1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。EcoRⅠ若反应16小时，所需酶量为正常酶切时间的1/8，即若反应时间为16小时，则所用酶量为只切1小时的1/8。其它一些酶也有类似情况，如HindⅢ为1/8；KpnⅠ为1/4；BamHⅠ为1/2。
4．终止酶切的方法
EDTA可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为10mM；加热是常用的方法，对于最佳反应温度为37℃ 的酶，在65℃ 或80℃ 处理20分钟可使酶活性大部分丧失。但是对于在80℃ 作用20分钟也有不失活的酶，如最佳反应温度为37℃ 的酶Bg1Ⅱ、HpaⅠ和PvuⅡ，65℃ 酶Tth111Ⅰ和TspRⅠ，以及50℃ 酶Bc1Ⅰ，可用苯酚抽提去除蛋白，或用试剂盒纯化DNA。
七、星星活性（star activity）
限制酶的特异性变化方式与酶的种类和所用的条件有关，最普遍的活性变化来自1个碱基的变化、识别位点外层碱基的随意性，以及单链缺口。
引起星星活性的因素有甘油浓度高（>5%），酶过量（>100U/ml），离子强度低（<25mM），pH值过高（>8.0），或是加了有机溶剂如PMSD （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、sulphalane等等，或是用其它二价阳离子如Mn++、Cu++、Co++或Zn++代替了Mg++。但不同的酶对上述条件的敏感性不一样，如PstⅠ比EcoRⅠ对高pH更敏感，但后者对甘油浓度更敏感。
抑制星星活性的措施有许多，如减少酶的用量（可避免过份酶切），减少甘油浓度，保证反应体系中无有机溶剂或乙醇，提高离子强度到100～150mM （如果不会抑制酶的活性的话），降低反应pH至pH7.0，以及保证使用Mg++作为二价阳离子。
八、单链DNA的切割
部分切割双链DNA的酶也可消化其单链，但是切割效率不同。HinPⅡ、HhaⅠ、MnlⅠ切割单链DNA的效率是切割双链的50%，HaeⅢ切割单链DNA的效率是切割双链的10%，BstNⅠ、DdeⅠ、HgaⅠ、HinfⅠ、TaqⅠ切割单链DNA的速度比切割双链慢100倍。还有一些酶不切割单链DNA，如AluⅠ、BbvⅠ、DpnⅠ、FnuDⅡ、FokⅠ、HpaⅡ、HphⅠ、MobⅠ、MobⅡ、MspⅠ、Sau3AⅠ、SfaNⅠ等等。
有些限制酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链缺口，即切口酶（nicking enzyme），如N.BstNBⅠ。这类酶在命名时前面要加一个N。目前已经商品化的这类酶共有7种。N.BstNBⅠ的识别序列和切割位置如下。
5′...G A G T C N N N N N ...3′
3′...C T C A G N N N N N ...5′
（1）将产生的5'突出端补平后，再连接可产生新的酶切位点。EcoRⅠ的识别位点是GAATTC，先用它来切片段，将5'突出端补平后，再连接可产生XmaⅠ（GAANNNNTTC）和AceⅠ（ATTAAT）酶切位点，而EcoRⅠ的酶切位点消失。
……G AATTC…… 补平 ….GAATT AATTC…. 连接 ….GAATTAATTC…
……CTTAA G…… ….CTTAA TTAAG…. ….CTTAATTAAG…
（2）同尾末端的连接。不同的同尾酶切割DNA产生的末端再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点却消失。例如BamHⅠ（G↓AATCC）+BclⅠ（T↓GATCA）→AlwⅠ（GGATC 4/5），又如XbaⅠ（T↓CTAGA）+AvrⅡ，或NheⅠ或SpeⅠ或StyⅠ（CCTAGG）→BfaⅠ（C↓TAG）也产生了新的酶切位点。
（3）平端连接。平末端的限制酶切割的DNA在连接后也可产生新的酶切位点，例如PvuⅡ（CAGCTG）+EcoRV（GATATC）→MobⅠ（GATC）。
影响酶切活性的因素有许多，概略的说可分为外因和内因。外因是可预见和控制的，如反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等等。内因包括位点偏爱性、甲基化底物、底物的构象。构象的影响主要指切割线性DNA和超螺旋DNA时的活性，如与切割lDNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶来切割pBR322的超螺旋DNA。PaeRTⅠ与XhoⅠ切割相同的序列（C↓TCGAG），但如果5'端为CT则PaeRTⅠ不能切割。
在基因组中碱基对的排列是非均匀的，因此尽管有的酶切序列中GC含量相同，但在基因组中出现的机率还是不一样。如在E.coli中，AsoⅠ（GGCGCGCC）切点平均20kb中出现一个，而NotⅠ（GCGGCCGC）切点平均200kb中出现一个（常利用它出现的机会少来构建图谱），EcoRⅠ和HindⅢ切点平均5kb中出现一个，而SpeⅠ（ACTAGT）切点平均60kb中出现一个。
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