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发酵工艺学原理讲义及思考题（一）

上一篇 / 下一篇 2009-02-28 20:34:46 / 个人分类：专业资料

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开课背景（1）何为工艺学？原来的工艺学的特性：

（2）现在：强化工艺学的基本理论背景，减小课时数，以单元操作为主线条的工艺学原理

第一章绪论

§1-1发酵工艺学的基本概念

一、发酵工业的基本概念

微生物学中的发酵的定义：

微生物发酵工业的概念：

1.发酵工业生产的基本模式

讲述生物工业的基本生产模式，引出生物技术、生物工程的概念，讲述两者之间的区别与联系

2.发酵工业的分类

酿酒业（啤酒、葡萄酒、白酒……）。

厌氧发酵调味品（酱油、醋）。

酵母工业——自然发酵。

氨基酸发酵——典型的代谢控制发酵。

抗菌素发酵——次级代谢控制发酵。

酶制剂工业——具有重要的意义，是工业发展的基础、科学研究的基础

有机酸工业—柠檬酸、葡萄酸、乳酸、琥珀酸等。

石油发酵——降低石油熔点（石油脱腊）有机溶剂工业——乙醇、丙醇等耗氧发酵

维生素发酵——VC、VB2

生理活性物质——白介——2

环境工业——废水的生物处理，废弃

物的生物降解

二、微生物发酵的基本特征

1.微生物发酵过程是一个典型的化工过程

由于微生物生理特性决定了微生物在发酵过程中需要稳定的环境、特殊的条件以及以氧作为底物的供给，这些多涉及到化工生产的一下领域：

（1）质量的传递——氧的供给、代谢物的排泄等

（2）热量的传递——微生物呼吸产热，微生物生长于代谢需要稳定的而严格的温度条件。

（3）动量的传递——涉及到搅拌轴功率的计算，他与溶氧、气液混合的关系

（4）微生物的反应工程——涉及到微生物的生长动力学模型的建立，产物生成动力学模型的建立。

2.微生物发酵过程是一个典型的代谢控制发酵

从微生物发酵的历史角度看，最早的微生物发酵是一个自然发酵过程，现代微生物工业通常是指微生物的代谢控制发酵？

定义：是指利用生物的、物里的、化学的方法，人为的改变了微生物的生长代谢途径，使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。

以GA发酵为例，建树微生物代谢控制发酵的意义。

3.微生物发酵工业又是一个有别于化工过程的一个工业

有以下几个特征：

（1）反应条件温和

通常由于微生物的生理特性，要求温度为30℃-40℃

pH值中性偏酸性——酵母、霉菌、放线菌等

pH值中性偏碱性——细菌的发酵

（2）无菌发酵

整个反应过程要求无菌：培养基无菌、空气无菌、补料和取样要求无菌操作、某些工程菌，其尾气也要求进行无菌处理。

（3）非连续性生产

微生物的生理特性决定了发酵过程的非连续性

大部分的工业发酵是以间歇操作为基础进行的，目前可以实现连续化生产的是：啤酒的连续化生产……

§1-2微生物工业发酵的历史及发展方向

一、微生物工业发酵的历史

微生物发酵有着悠久的历史，几千年前的酿造实质上就是一个典型的微生物发酵过程，尽管……

近几十年的来微生物发酵不但在应用领域上更加广泛，更重要的是建立了许多新的微生物发酵理论体系，诸如：代谢控制发酵、基因工程菌发酵等……微生物发酵的发展可以分为以下几个阶段：

1.自然发酵阶段

传统的酿造业，目前在国民经济和人民生活中仍然占有重要的地位。

2.纯培养阶段

这一阶段是微生物发酵工业从自然发酵发展到今天的代谢控制发酵的转折点，由于微生物纯培养技术的建立和发展，大大推动了发酵过程的控制，提高了发酵生产效率，更重要的是推动了微生物学科的发展，使人们从简单的发酵现象中发现了微生物的存在，进而对微生物有了进一步的认识和了解；在此基础上发展起来的菌种的分离、无菌技术、纯培养技术、菌种诱变等为后来的微生物发展奠(dian)定了基础。

3.通气搅拌发酵阶段

1929年，弗莱明发现了青霉素，并证明了其在医学上的作用，但是青霉素的工业化生产却限制了他的广泛应用，特别是20世纪的三、四十年代广泛流行的肺结核，以及第二次世界大战期间大量的伤病员，推动了青霉素工业化生产的科学研究与开发。当时，1000个300ml的三角瓶连续摇动7天，方能生产出80万单位的青霉素1只，可见……。后来美国的化学工程师参与了青霉素的工业化生产的研究，发明了一个2吨的通气搅拌发酵罐，……

4.代谢控制发酵阶段

代谢控制发酵的概念的提出最早源于日本人在GA发酵上取得的成功。1956年日本人“木下”，利用……成功地进行了GA的发酵法生产，从此以后，“木下”　等人致力于相关的发酵的理论研究，并正式提出了“代谢控制发酵” 的概念。利用代谢控制发酵的基本理论，目前已成功地进行了大多数的氨基酸的发酵法生产，同时也完成了诸如：肌苷酸（AMP）、干扰素等新型药物的开发生产。

代谢控制发酵理论的建了和应用为微生物工业发酵的理论和实践作出了重大贡献，也是未来微生物发酵工业研究和发展的方向（为何这样讲？）大多数的工业产品并不是微生物代谢的末端产物，而是微生物代谢的中间性物质，要合成、积累这些物质，必须解除他们的代谢调控机制……

二、微生物发酵工业的发展方向

微生物发酵工业有着悠久的历史，在国名经济中占有重要的地位，21世纪又是生物的，体现在哪里？

1. 从工业领域看

微生物发酵将占据越来越重要的地位，具体的讲：

（1）通过生物工程解决能源问题

能源问题是全球面临的问题，生物工程如何解决？

太阳能　淀粉、纤维素酶工程 G 发酵乙醇能源

乙烯

（目前已取得突破性进展）

生物工程作为桥梁，2000年世界产值已达50亿美元

（2）取代部分化工工业

许多化工产品的生产由于严重的污染和生产效率问题，而为生物工程取代，例如：乙醇、甘油、乳酸等

（3）农业：生物农业、农产品加工等方面

（4）医药：

2.从产品角度看，应围绕下列领域：

（1）酶制剂工业：即是生产工具，又是科学研究的工具和基础

（2）新型抗菌素工业和维生素行业

（3）氨基酸及多肽发酵

(4)生物免疫物质：白介素-2、干扰素、抗肿瘤物质等

（5）细胞工程及疫苗

3.从科学技术角度看

（1）底物基质的转变

以葡萄糖为底物的发酵转变为以更为广泛的基质为原料，特别是以废弃物为基质的发酵，废弃物资源化是其发展方向。

（2）开发新产品

利用现代生物技术为基础，开发新产品，新的产品层出不穷，使得微生物发酵向国民经济的各个角落渗透。

（3）微生物发酵向着大型化、自动化、连续化的方向发展。

英国帝国化学公司，甲烷菌发酵罐的容积已达到3000m2

自动化：电子计算机的广泛应用以及发酵过程中的各种参数的自动检测，使得……

三、建国50周年，发酵工业回顾？

四、本课程的内容和任务

本课程是生物工程专业本科生的专业基础必修课程，是一门以微生物、生物化学、化工原理等课程为基础，以微生物发酵过程中各种单元操作为主线条，对微生物发酵过程中的基本原理进行阐述的课程。

其基本内容如下：

1. 发酵生产用菌种及其有关知识

菌种选育

包括菌种保藏

生产过程中菌种的扩大培养

2. 培养基的制备及灭菌

包括：工业发酵用原料的选择与处理

培养基的灭菌原理和方法

工业灭菌的工程计算

3. 发酵机制

包括：乙醇、甘油、谷氨酸、柠檬酸、赖氨酸、抗生素等

4. 发酵过程及控制

包括：温度的变化及控制

pH值的变化及控制

氧传递动力学

泡沫的消长规律及控制

教材：酶乐和：生化生产工艺，浙江大学出版社

参考书：

1. 姚淑华：微生物工程工艺原理，华南理工大学出版社

2. 刘如林：微生物工程概论，南开大学出版社

3. 张克旭：氨基酸工艺学，轻工业出版社

4. 陈宁:代谢控制发酵，轻工业出版社

思考题：

能源问题是全球面临的问题，生物工程将如何解决？写出一遍综述。

第二章微生物发酵用菌种及其扩大培养

§2-1微生物发酵工业用菌种

一、微生物发酵工业用菌种的特点及要求

微生物发酵工业用菌种因不同的发酵对其要求各异，就是同一种产品的发酵生产，其菌种的特点和要求因不同的原料和生产设备的不同也有很大差异，例如：GA 的发酵：

以淀粉质为原料：要求VH-,

以糖蜜为原料：因为糖蜜本身含有非常丰富的VH……

但是作为工业微生物发酵使用的菌种，通常有下列特点：

1.具有稳定的遗传学特性

这对于工业化生产是很重要的，通常工业化生产整个周期很长，在一个发周期中，菌体至少应该增殖一次，在增殖过程中，菌体应该保证原菌的遗传学特征，（尽管菌体生长的环境改变了，压力、基质、溶氧等）

2.微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求

换言之，可以广泛的使用各种原料作为生产用的底物，某些微生物对于底物有着严格的要求，对于碳源要求单一，这对于微生物的发酵工业提出了严格的要求，增加了生产成本。

3.生长条件易于满足

在微生物的工业化生产过程中，某些环境条件很难实现。氧的传递和供给就是一个很难完全满足的条件，特别是对于高粘度、高浓度的发酵体系。

对于微生物的生长往往存在一个“临界溶氧浓度”，低于这个溶氧浓度，氧就成了微生物生长的限制性因子，这个溶氧浓度越高，说明菌体生长条件越易满足，从另一种意义上讲，工业化的生产成本就越低。

pH值:中性偏酸性，偏碱性，强烈的pH值易改变产物和底物的状态。

4.对于细菌，希望具有抗Phage的能力。

5.具有较高的各种酶活力，可以在一定的范围内提高生长速率和反应速度，进而可以缩短发酵周期，降低生产成本。

6.对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶。

对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎；

对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体内，对于包含体，要求在细胞破碎是不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。

二　微生物发酵工业用菌种的种类

野生型

从菌种的遗传学特征上可以把菌种分为：

培养：营养缺陷型……

从微生物分类学的角度，分为

1. 细菌类：短杆菌：GA,Gln,lys……

枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等

地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) α-Amylase

苏云金芽孢杆菌：BT生物农药……

梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等的发酵

2. 酵母菌啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵

酒精酵母：

汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵

假丝酵母：scp生产，石油发酵

3.霉菌黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业（UV-11,UV-48）、酶制剂工业（糖化酶）

黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱

青霉菌：青霉素的生产

红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产；使用红色色

素的生产；豆腐乳的生产等

赤霉菌：赤霉素的生产，是一种植物生长激素

4.放线菌：各种抗生素，链、土、庆大等

§2-2微生物用菌种的扩大培养

一、菌种扩大培养的目的

1.提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。

目的就是：a、缩短发酵周期

降低能耗、减少染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的）

b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑制杂菌的生长。

从对数残留定律上看，任何灭菌过程都不能够做到绝对无菌，抑制杂菌生长除了严格环境以外，在数量上让培养菌占绝对优势也是一种方法，往往是一种行之有效的方法。例如：啤酒的发酵……

2.让菌种从固试管、液体试管……，逐步适应，

例如：啤酒发酵

3.菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐”现象。

许多生产菌种往往都是“溶原性”的？

通过连续的扩大培养，每一级都要进行严格的检查，对于不合格的严禁使用，无疑增加了生产的可靠性。

二、扩大培养的方法

通常有两种方法：固体法：用于酿造业（酱油、白酒等），也是源于酿造业，有霉菌的纯培养，也有混合培养如：大曲

液体法：液体深层培养，适合于众多发酵行业

1. 液体扩培流程

固体试管三角瓶大三角瓶一级种子二级种子

三级种子

发酵罐

2. 固体扩培流程

固体试管三角瓶种曲麸曲（机械通风制曲）

两者的优缺点比较：

固体培养

（1）酶活力高。（因为菌丝体密度大）

（2）生产过程中无菌程度要求不是很严格。

（3）对于固体培养，通常用于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以有效的降低产品分离成本。

缺点：

（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。

（2）周期长。

（3）培养过程中环境条件控制较难。

（4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种菌类不纯。

液体培养

（1）生产效率高，便于自动化管理。

（2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以实现全面控制。

（3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。

缺点：

（1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。

（2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产密度大而难以实现。

现代生物技术的发展是以基因工程菌为主导的微生物发酵领域，其菌种的培养要求无菌程度高，而且培养过程中的条件要求也非常严格（否则易发生变异导致质粒丢失），从这种意义上讲，固体菌种的制备是难以实现的，因此，应以液体培养为主导方式。

应该指出的是：

随着生物工程与技术的发展，许多传统的应用微生物工业的菌种已形成了产业化。例如：酒精的生产

原生产工艺流程为：……

其中以酵母为线条的生产工艺为：

以霉菌为线条的生产工艺为：

现在：（1）酵母使用粉末酵母鲜压榨酵母固定化酵母细胞

（2）霉菌则由各种液化、糖化酶取代

三、菌种扩大培养的条件：

菌种扩大培养条件因不同的菌种差异是非常大的，通常是与菌种的性质有关的，也与后续的发酵工艺有关。但是，与发酵工艺却有着很大的差别。

1.培养基：

种子培养基因不同的微生物种类差别是很大的，同一种微生物因不同的扩大培养过程（一级、二级）其培养基往往也有较大差异。

例如：啤酒酵母扩大培养用的培养基组成如下：

固体试管液体试管三角瓶大三角

（无酒花）（有酒花）（有酒花）

汉逊罐

通常，对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基也不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源；对于种子罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌体的增殖。

例如：HASS（高温淀粉酶）

三角瓶用碳源：葡萄糖+乳糖

3m3种子罐：液化淀粉

2.温度

种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。

例如：啤酒酵母扩大培养

固体液体三角瓶大三角瓶汉逊罐

28℃ 25℃ 20℃ 15℃ 10-15℃

需要指出的是：

（1）许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：30℃，而产物合成温度为32-34℃

（2）种子扩大培养的温度的选择，应该考虑的是菌体的快速增殖上，一方面可以缩短周期，另一方面有利于抑制其他杂菌的生长。

3.氧的供给

菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧气，无论是厌氧发酵还是好氧发酵。

足够的溶氧取决于：搅拌转速、通气量、搅拌轴功率等，后述。

4.pH值

菌种扩大培养的pH值很重要，直接影响到菌体的正常生长，需要注意以下两点：

（1）扩培选择的pH值是菌体的最适生长pH值，往往与发酵最适pH值不同。

（2）培养基灭菌后，通常其pH值要下降0.5——1.0个单位，因此，……

（三角瓶灭菌后，不能够调整pH值，不宜无菌操作）

思考题：

1.比较固体培养与液体培养的优缺点。

2.说明菌种扩大培养的条件。

3.菌种扩大培养的目的和意义是什么？

4.工业生产用菌种的基本要求有什么？

第三章微生物用培养基及灭菌

本章的主要内容：

1.培养基的制备

2.starch 的水解

3.培养基的灭菌

约4学时

§3-1培养基的制备及要求

一、培养基用原材料及要求

微生物发酵领域其本质，也可以理解为物质形式的转化过程，就是利用微生物生长所需的底物转化成特定的产物，在这个过程中，有两个问题是工业化需要解决的：（1）产物的社会效益，

（2）物质转变过程中产生的经济效益，即：低价值的原材料、低能耗等

对于特定的已知产物，在选择培养基原料时，则应注意以下几个原则：

1、培养基原材料的要求

（1）价格低廉，易得到（价格低，但不一定易得到，例如：地瓜干）

（2）对微生物的生长繁殖和代谢无抑制作用的物质

（3）微生物的代谢产物无有害物质。

2、培养基用原材料的种类

碳源 starch 及其水解糖液

含有starch 及其水解产物的废弃物：味精废水、粉丝生产废水等

化工石油产品：醋酸、甲醇、乙醇、甲烷等

氨水、尿素（有脲酶的微生物），以流加形式使用

(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4CL等

氮源豆粕、玉米浆、酵母粉、酵母浸出物、鱼粉、

菌体蛋白？、玉米蛋白粉等

二、培养基的种类固体发酵

生产培养基厌氧发酵

需氧发酵

按用途可分为：种子培养基

摇瓶培养基（优化工艺……）

检查培养基：HASS发酵用的检查培养基：

营养琼脂0.5%—0.55%、Sarch 2%，Glucose 0.5%

平板培养，根据透明圈的大小

本章涉及到的培养基为：生产使用的培养基

三、培养基的制备

1.培养基配制的原则

培养基制备是发酵成功与否的第一个要点，制备一个完整而科学的培养基是很重要的，也是非常艰巨的任务。通常制备培养基需要考虑以下几个方面的问题：

（1）合适的C/N，

不同的微生物、同一种微生物不同的菌株，其对培养基中的C/N要求是不一样的，同一菌株在不同的发酵阶段，其对C/N的要求也不一样。

例如：黄源胶（Xanthan Gum发酵）：前期，较低的C/N，目的是强化菌体的生长和增殖：但是，在黄源胶的生物合成期，则需要较高的C/N，假如在这一时期，培养基中氮源仍然很高，其导致的发酵结果是，底物消耗了但产物的产率却很低。

在大多数情况下，C/N要求在0.2——2.0。对于一些特殊的情况，例如谷氨酸发酵，在谷氨酸生物合成期，则要求C/N为：100/15-21。

（2）在确定了C/N的前提下，需要研究的是不同的氮源，对发酵的影响。

虽然C/N确定，但是氮源的利用其本质就是：pr 肽 AA,通过AA而被利用，不同的氮源，其AA的组成与比例也不相同，对其发酵结果的影响也不相同。有人在HASS(高温淀粉酶)的发酵过程中，向培养基中添加某些AA（亮，异亮）则有利于高温淀粉酶的合成基因的表达，发酵液中的酶活力则明显得到提高。

（3）大多数的工业培养基都使用玉米浆。

玉米浆内含有VH，它是菌体生长和代谢的所必需的一种辅酶，通常玉米浆与：

a. 菌体的增殖速度有关

b. 与菌体细胞膜的合成有关，从而影响到细胞膜的通透性

c. 对于某些菌体，与代谢途径和代谢机制有关。

（4）生长因子：

大多数菌体的生长因子如下：

a. 维生素：大多数维生素是微生物生长的辅酶，需要量很小，1—50µg/L。

b. AA，凡是微生物自身不能合成的AA则必须以游离的AA或者小分子的肽提供，通常，以小分子的肽提供，微生物更易通过细胞膜进入菌体内部 ?，如果提供外援氨基酸，需要注意的是各种氨基酸的平衡。

c. 嘌呤及其衍生物

2.培养基的优化方法

一种合成培养基的设计，需要考虑的因素是很多的，需要研究的成分也是很复杂的，其中包括碳源、氮源、玉米浆等，即便是碳源还可以是几种碳源的混合体，再加上述几种因素之间的相互影响，要确定一个科学的培养基配方是需要做大量的工作的，采用一个合理的数学方法，就可以在减少工作量的前提下，得到科学的结果。

介绍一种数学方法：均匀实验设计方法——旋转正交实验方法. 这是在正交实验的基础上发展起来的一种对于多因素、多水平的一种实验设计方法。

参考文献：方开泰:均匀正交实验方法

雄宗贵:发酵工艺学原理

§3-2培养基用材料及处理

发酵培养基用原料是非常广泛的，许多原材料需要经过处理后方能够使用，特别是以淀粉质为原料的发酵工业，大多数的情况下需要将淀粉进行水解处理。

本节内容：starch的水解；糖蜜的预处理；工业用添加剂

一、淀粉的水解

许多微生物由于其本身的生理生化特性而决定了其代谢所需的底物只能使Glucose等单糖，主要有下列菌种：

酵母：G、F、蔗糖、半乳糖、以及部分麦芽糖等

大部分的细菌：GA产生菌、Lys产生菌、苏云金芽孢杆菌等

其中：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌则可以以淀粉为原料。

霉菌：大部分的霉菌可以直接使用淀粉为原料，他们本身具有淀粉的水解能力。

淀粉的水解方法主要有酸法、酶法以及介于这两者之间的酸酶法、酶酸法，分别介绍如下：

1.淀粉的水解方法

（1）淀粉的酸法水解

水解原理：

淀粉是由葡萄糖通过α-1，4或α-1，6葡萄糖苷健连接而成的含有多个葡萄糖的大分子长链物质，根据其葡萄糖连接的糖苷健的不同，可分为枝链淀粉和直练淀粉，可以使用重合度来表示淀粉分子的大小，所含有的葡萄糖苷健的数量，称之为淀粉的重合度，用DP来表示。淀粉内部的葡萄糖苷健在一定的温度和酸性的条件下可以水解，而使淀粉分子链断裂，高温可加速葡萄糖苷健的水解速度。

水解条件：高温，120℃以上，

H+, 0.2MPa 的压力

缺点：反应条件比较强烈，产生的副产物较多.

主要有下列副产物：

a. 双分子葡萄糖脱水，形成复合二糖，分别是异麦芽糖、龙胆二糖，

前者不利于产物的结晶提出，后者对于菌体的生长有抑制作用。

b. 一分子葡萄糖脱水，形成5-羟甲基糠醛，对于菌体的生长有抑制作用。

c. 一分子葡萄糖和—NH2反应，形成氨糖，是淀粉水解糖液有色物质的主要来源。(美拉得反应)

2.酸酶法

3.酶酸法

4.双酶法：使用两种淀粉水解酶：α-淀粉酶

淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶。

α-淀粉酶：又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉α-1，4葡萄糖苷健，其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精，液化的含义？其水解速度随着淀粉链长度的降低而变得越来越慢，换言之，该酶不可能将淀粉完全水解成葡萄糖（从水解葡萄糖苷健的种类，水解速度到最后已无工业意义三个方面），因此该酶的淀粉水解产物中以短链的糊精为主，含有少量的葡萄糖。

淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶，又称为糖化酶，可以水解淀粉分子的α-1，4；或α-1，6葡萄糖苷健，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速度越快，水解产物为葡萄糖。

酸法与双酶法的优缺点比较：

（1）酶促反应条件温和，水解产生的副产物少，对微生物的生长有利。

有的人会问？目前采用的耐高温α-淀粉酶的作用温度也是较高，突破100℃，和酸法水解的温度相差不多。双酶法淀粉水解首先使用耐高α-淀粉酶进行淀粉的液化，此时水解液中的葡萄糖很少，不具备生成副产物的物质条件。

（2）正因为上述原因，淀粉水解产率较高，通常糖的转化率可以提高10%以上。这可以给味精、制药的领域带来巨大的经济效益。

例如：对于年产10000吨的小型味精厂，年增产100吨味精，直接经济效益可达到：0.8*100=80万元。

（3）可以直接使用粮食进行双酶法水解，因为双酶法水解的条件温和，对于粮食中的蛋白质等其他物质的破坏较少。

（4）双酶法水解使用的淀粉乳浓度较高，可以达到20Be以上，而采用酸法水解，淀粉乳的浓度通常只有12Be，原因？（副产物）意义？（设备利用率）

介绍液体浓度Be的概念：

波美度（Be）是表示液体浓度（比重）的一种方法，其和液体比重之间有下列关系：

d = λ/λ- Be

式中——d：液体的比重

λ：模数

λ因标定的温度不同可将波美表分为：

美国：15.6℃标定，λ=145

合理：15℃标定，λ=144.3

荷兰：12.5℃标定，λ=144

标定方法：

轻表：“0”Be的位置，把表放在一定温度下的蒸馏水中的位置；

“10” Be的位置，把表放在一定温度下的比重为0.9351

的溶液中的位置。

重表：“0”Be的位置，该位置是把表放在一定温度下的蒸馏水中；

“66”Be的位置，该位置是把表放在一定温度下的比重为1.842的浓硫酸溶液中。

表示溶液的比重的方法还可以使用Bx(玻利克斯)：

定义：某一溶液的Bx，表示该溶液的比重和相同浓度（为Bx%）的蔗糖溶液的比重相等。

注意： Bx的概念不同于波美度，他与比重之间是没有计算公式的，但是可以查找有关换算关系。

2.淀粉的双酶法水解工艺

淀粉调浆液化糖化过滤糖液

浆液浓度：20—30Be,调pH值6.0—7.0，

添加CaCL2,使用量，0.01mol/L（目的？）

液化：耐高温α-淀粉酶，酶的使用量：5—8单位/g淀粉

温度：105℃；时间，20—30分钟

降温：采用喷射冷却方法：

糖化：使用淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶；

使用量：根据液化淀粉的浓度，30%的浓度，80—100单位/g淀粉

温度：65℃

终点判断：时间，2—3小时。

二、糖蜜的处理

1.糖蜜的主要成分

（1）糖，49—50%，因不同的原料和生产方法不同而异，主要是蔗糖

（2）胶体物质，5—10%，来自于原料

（3）灰分，10—12%

（4）生物素，1—10mg/Kg(甘蔗)，0.04—0.06 mg/Kg(甜菜)

（5） pH值6.2(甘蔗)，7.4（甜菜）

对于发酵工业可以利用得的主要成分是：糖和生物素

2.用途

（1）发酵工业用原料，国内发酵生产的有：味精、酵母

目前，国内酵母工业使用进口糖蜜为原料，带来了较大的工业污染，……

（2）使用糖蜜生产酒精

（3）使用糖蜜生产蒸馏酒——姥姆酒，世界名酒，牙买加的国酒，在西方国家主要用于鸡尾酒的勾兑上。

（4）作为添加剂使用，柠檬酸发酵，作为添加剂使用。

（5）使用糖蜜发酵生产黄源胶，已有研究报道。

3.处理方法

处理目的：

a.除去胶体性物质，降低糖蜜的粘度，提高发酵液的流动性，有

利于改善发酵过程中氧的传递。

b.脱色，除去有色物质（有色物质的来源？），对产品的质量有影响，对微生物的生长和代谢有影响。

c.中和过量的酸碱性物质，除去部分对pH值有影响的缓冲性物质。

方法：a.冷酸通风沉淀法，即加酸后，通风，使之沉淀

糖蜜经酸化后主要是除去糖蜜中胶体性物质，通风的目的是除去一些挥发性物质。（教材中提到的通风是为了提高KLa是错误的）

b.加絮凝剂（PAM）

聚丙烯酰胺（ PAM）作为絮凝剂，可以促进大分子物质的沉降，有利于糖蜜的澄清。

工艺过程：

原溶液（稀释） 40Bx 调pH值(3—3.8) 絮凝静置

絮凝剂的用量：8mg/L，静置时间：1小时

加热到90℃

C.活性炭吸附法

可以除去糖蜜中的有色物质，明显的降低糖蜜的色泽，对发酵的产品的提出和产品质量有益。

缺点：活性炭的使用量较大，处理成本较高。

三、工业培养基的添加剂

添加剂通常是指除了培养基中的C、N、无机盐、金属离子以外的其它物质，主要有：

1.前驱物质

特别是对于某些氨基酸、核苷酸和抗菌素的发酵生产，添加一定量的前驱物质（前体）其作用是非常明显的。

基本原理：

（1）S 前驱物质产物

反馈抑制的存在，需要添加前驱物质

不存在抑制或阻遏

（2）S 前驱物质的和成效很低，需要添加前驱物质

（3）S X 前驱物质产物

存在分枝代谢，不能够很好的解决分枝代谢对X的反馈抑制作用，须要有添加剂

注意：

前驱物质的使用，因不同的菌种、不同的产物、不同的代谢机制而使用的方法不同，使用的浓度也不同，但都是建立在对其代谢调节机制有从分的了解的基础上的。

2.代谢促进剂和代谢抑制剂

促进剂主要是指诱导物，在酶的生产；抑制剂主要在抗菌素的生产中使用的较多。

例如：（1）四环素发酵过程中，添加NaBr,可以抑制金霉素的生物合成，从而提高四环素的产率。

（2）头孢霉素C，添加L—Met，可以抑制头孢霉素N的生物合成，从而提高头孢霉素C的产率。

上述这些情况，抑制剂对代谢的抑制作用是发生在代谢链具有分枝代谢上的，如下图所示：

S A B C 产物

副产物（X）抑制剂作用点，通常是X的结构类似物

§2-3培养基的灭菌

一、灭菌原理

所谓灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢，这一概念不同于消毒。后者是指消灭一切致病微生物（病原体）

灭菌的方法很多，在实验室可以使用干热灭菌、对于环境可以使用化学试剂灭菌，但化学试剂的灭菌方法有很大的限制。

在工业生产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌？

湿热灭菌的显著优点是：使用方便，无污染，而且其冷凝水可以直接冷凝在培养基中，也可以通过管道排出。

下述内容就是针对湿热灭菌的。

首先讨论几个基本概念：

1.微生物的热阻

定义：微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。其对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的概念。

相对热阻：两种微生物的热阻之比。

例如：芽孢/大肠杆菌=3000000/1；病毒/大肠杆菌=1—5/1等

2.理论灭菌时间

微生物的湿热灭菌过程，其本质上就是微生物细胞内蛋白质的变性的过程。因此，可以把灭菌过程看成是蛋白质的变性的过程，从这个意义上讲，灭菌过程应遵循单分子反应的速度理论，那么，则有下列方程：

-dN/dt = k * N

式中——-dN/dt：表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率

N：表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数

K：表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数，

K=f(灭菌温度、菌种、培养基等)

上式的积分形式为：

t = 2.303/k * lnN0/NS

式中——N0，NS：分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个/ml）

k：意义同上

t ：表示理论灭菌时间

理论灭菌时间的计算需要注意以下几个问题：

（1）K值因不同的微生物种类不同、不同的生理状态、不同的外界环境，差别很大，实质上，它是微生物热阻的一种表示形式，微生物的热阻越大，K值也越大。

例如：芽孢，在121℃时，K=60/s

营养体，在121℃，k=60—6*1010/s

(2)在计算过程中，N0，NS如何取值？

N0 = 芽孢性细菌总数 + 芽孢数

灭菌时温度升高，营养体即可变成芽孢

对于 NS ，如果取NS = 0，那么，t = ∞，这显然是与现实情况不符。

对于如何NS取值？通常取NS = 10-3，这个数值如何理解？灭菌1000次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。这个数值的取值的大小，也间接反应了该生产过程中的技术管理水平。

（3）上述灭菌时间，通常称之为理论灭菌时间，只可以用于工程计算中，在实践过程中，因蒸汽的压力问题（不稳定）、蒸汽的流量问题有很大差别，甚至培养基中的固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素，都会影响灭菌效果，因此在实际生产中，通常采用经验数值：

间歇灭菌，121℃，20—30分钟

连续灭菌，137℃，15—30s，在维持罐中保温8—20分钟。

3.灭菌温度的选择

灭菌温度的选择应考虑的因素主要有：

a.微生物的热致死温度，应高于该温度。通常以芽孢为准。何为热致死温度？（10分钟，全部死亡的温度）

b.营养成分的破坏，灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程因此，灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。

许多实验研究结果表明，培养基在高温灭菌的过程中，其营养成分的破坏在很大程度上可以用一级反应来描述其反应速度：

dc/dt = - K，×C

式中——dc/dt：表示营养成分破环的速率，

C：表示营养成分的浓度

K，：为反应速度常数，1/s，K = f( t,……)

反应速度常数K，与温度的关系，可以使用阿累尼乌斯公式表示之：

K， = A，×e[-E/RT] ……（1）

式中——K，：反应速度常数，1/S

E,：反应的活化能（J/mol）

R：气体常数，1.987*4.18 J/mol*k

T：反应的绝对温度，k

同样，灭菌过程中的反应速度常数也可以用下式表示出：

K = A×exp[-E/RT] …… （2）

（1）、（2）式可以改写成下列形式：

lg(k,2/k,1) = E,/R×(1/T1 – T2 ) …… （3）

lg(k2/k1) = E/R×(1/T1 – T2 ) …… （4）

（3）（4）的意义是指：反应的温度从T1 升高到 T2 ，其反应的速度常数分别从k,1 增加到 k,2；k1 增加到 k2；

培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行性反应，

如下所示： B

对于平行性反应，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加，但增加的幅度（大小）却不同，其比值可以表示为：

lg(k2/k1)/lg(k,2/ k,1)= E / E, …… (5)

实验证明：营养成分为破坏的反应的活化能E的值为

E, = 8.36—83.6*103 J/mol

而菌体死亡的活化能E

芽孢：E = 418*103 J/mol

E =

无芽孢：E = 209—250*103 J/mol

显然，（5）式的比值〉1，说明提高温度对于第二个平行反应，即菌体死亡的反应是有利的。提高温度，虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了，但是，达到同样的灭菌效果，所需要的时间却缩短了，由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常速增加的少，因此，有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成分是有利的。通常所说的高温短时灭菌可以提高生产效益，其理论根据就在于此。

但是高温短时灭菌是需要一定的设备条件的，通常需要连续化的灭菌工艺流程？（高温后的快速冷却在大型的生物反应器内是很难实现的……）这就给中小型生产企业带来了一定的困难，设备投资的增加，技术管理水平的提高（培养基连续灭菌后，后述设备的无菌化管理对于整个体系的无菌操作是必需的……）

高温短时灭菌的优点还可以表现在：节省能量上，培养基的预热？

二、培养基的工业灭菌方法

培养基的工业灭菌通常涉及到以下几个概念：

1.空消:

意义：由于空消时反应器内的死角少，蒸汽的传热效率高，对于反应器灭菌效果好，通常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。

采用培养基连续灭菌的工艺，需要空消。

2.实消：定义？

优点：不需要特定的设备，操作、管理比较灵活。

3.连消：定义？

优点：营养成分破坏少，生产效率高

热综合利用率高