氨基酸直接分析法原理及应用

氨基酸直接分析法原理及应用牟世芬* 丁永胜 （中国科学院生态环境研究中心 北京 100085） (Dionex 中国公司应用研究中心， 北京 100085) 提 要 本文介绍一种新型氨基酸分析方法—离子交换色谱-积分脉冲安培法(HPIC-IPAD)，详细讨论方法的原理和应用，该方法与传统方法比较，无须进行柱后或柱前衍生反应，对氨基酸可以直接进行分析，灵敏度高，大多数氨基酸的最小检测限均小于1pmol，线性范围可以达到3个数量级以上。关键词：氨基酸，离子交换色谱-积分脉冲安培法 1 前言 较为经典的氨基酸分析方法是阳离子交换分离, 柱后衍生反应，紫外分光或荧光检测[1]。常用的衍生试剂有茚三酮（Ninhydrin）和邻苯二甲醛（OPA）。此外还有柱前衍生-反相分离，衍生试剂有 AQC(6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl- carbamate)，FMOC(9- fluorenylmethylchloroformate)，Dabsyl(4-di- methylamino-azobenzene sulfonylchloride)， Dansyl等。这些方法的缺点是操作复杂和影响因素多，如柱后衍生需要柱后衍生反应的附加装置和衍生试剂；柱前衍生虽然克服了柱后衍生的一些缺点，但存在氨基酸衍生物的不稳定，衍生反应的副产物和试剂本身干扰等缺点[2]。本文将讨论的美国Dionex公司新近推出的氨基酸直接分析方法是基于阴离子交换分离，积分脉冲安培法检测，无需将待测氨基酸转变成可被检测的化合物的衍生反应。 2 方法原理 2.1 阴离子交换分离迄今为止，自然界中已发现180多种氨基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种，称为基本氨基酸。这些氨基酸的基本结构通式如下： H R—C—COO - NH3+ 氨基酸具有两性离子结构，在酸性介质中，以氨基阳离子状态存在；在碱性介质中，以羧基阴离子状态存在，这也是氨基酸分离分析方法的基础。氨基酸直接分析用疏水性薄壳型阴离子交换树脂为固定相，碱性溶液为流动相，阴离子交换分离，积分脉冲安培法直接检测。流动相由水、氢氧化钠和醋酸钠溶液组成。其中氢氧化钠不仅提供淋洗离子OH-，而且碱性pH 条件也是氨基酸在金电极表面进行氧化反应，实现积分脉冲安培检测的必须条件。醋酸根离子（Ac-）对固定相的亲和力大于OH-，它对于极性较小，保留较强的氨基酸起“推”的作用。表1列出了分析氨基酸的典型梯度淋洗条件[3]。图1是常见氨基酸混合标准溶液的色谱图[3]。 作者简介：牟世芬，女，中科院生态环境研究中心研究员，博士生导师，主要从事离子色谱应用基础研究。 TEL: 010-62849239, E-mail: [url=mailto:shifenm@mail.rcees.ac.cn]shifenm@mail.rcees.ac.cn[/url] 图1. 常见氨基酸混合标准溶液的色谱图 Figure 1. Chromatogram of Standard Amino Acids 表1 水解产物中氨基酸分析的典型梯度淋洗条件 Table 1　Typical　Gradient Conditions For Analyzing Amino Acid in Hydrolysates 时间Time（min） E1 E2 E3 备注（流速：0.25mL/min）初始0.00 2.00 8.00 11.00 18.00 21.00 23.00 42.00 42.10 44.10 44.20 75.00 76767664644044141420207676 24242436362016161680802424 00000404070700000 装样阀切换进样开始OH-梯度淋洗, 阀复位开始醋酸钠梯度用高浓度氢氧化钠冲洗柱子系统开始重新平衡,恢复到初始状态注：E1= 纯水， E2= 0.25 M NaOH， E3= 1.0 M NaAc 2.2脉冲积分安培检测在高pH溶液中，含有脂肪氨基（-NH3）的化合物可在金电极上被氧化，因此可用电化学法检测，然而由于金电极吸附待测成分的氧化产物以及金电极表面形成氧化层，金电极会很快失效。为了解决这一问题，发展的电化学检测醇类和含氨基化合物的脉冲电化学检测器，由三个不同的脉冲电位代替直流安培检测器中的加于工作电极上的恒定电位。较工作电位高的正电位用来除去金电极上被测成分的氧化产物。由于金电极本身会部分被氧化成氧化金，再加一个大的负电位，使氧化金还原到还原状态。该脉冲每0.5~1秒循环 1次。Polta等[4]首次报道了氨基酸的脉冲电化学检测。在金电极上得到氨基的最大氧化电流所需的电位超过金表面氧化的电位，金电极表面氧化所产生的电流无疑会增加背景和基线噪音以及基线的不稳定性。为了增加氨基氧化时所产生的检测信号，抑制金电极氧化所产生的背景信号，1989年Johnson等人[5]引入了一个新的技术—脉冲积分安培。与脉冲安培相似，积分安培法中加到工作电极上的也是一种自动重复的电位对时间的脉冲电位波形，其不同之处是采样时的电位不是恒定的，而是在高-低值之间扫描。在高电位时，氨基和金的氧化同时发生。在高电位时所形成的氧化金在低电位时被还原。因为在低电位时金的氧化是可逆的，而氨基的氧化是不可逆的，因而来自金电极氧化的信号被大大抵消，由积分整个高-低循环的电流所得到的信号仅仅是被分析成分的信号。检测氨基酸和氨基糖的积分安培波形与早期的波形相似，但首先用负电位为清洗电位，这样可较好地保持电极的清洁和活性，不会引起电极和信号的损失。在前述的脉冲安培法中，首先用高的电位为清洗电位，金电极的过量氧化会导致检测响应值的逐渐降低。经过对检测氨基酸和氨基糖的施加电位波形的优化克服了基线漂移，改进了线性、信噪比和长时间的重复性，而且不损坏金工作电极。新的波形如图2所示，由六步组成，分为三个区，E1和E2为吸附/引发区，E3 和E4为电流积分区，E5和E6为清洗/活化区。吸附步骤的施加电位E1，一般为负电位，其大小和持续时间影响吸附氨基酸的灵敏度，导致吸附氨基酸和非吸附氨基酸的响应因子的扩大，影响碱性氨基酸的线性范围。因此必须控制E1的持续时间，一般小于40ms。E2 是提供一个可以开始积分而氧又不会被还原的电位。开始积分之前在E2的延迟时间允许充电电流减弱。短的延迟时间大大减小由于醋酸钠梯度所引起的色谱基线改变以及不同氨基酸响应因子的差距，E2的推荐时间为60ms。为了得到最高灵敏度，E2亦应为负电位（-0.05V），使金电极完全还原，同时氨基酸的吸附在较低的速度下继续进行。开始积分时，第一积分电位E3上升到足以氧化氨基酸和电极表面被氧化的正电位，一般应大于0.20V，最佳值在0.25~0.30V之间。受金电极氧化的限制，E3不宜太高，否则背景和噪音将增加。在第二积分电位E4，积分电位由E3降到E4 （积分开始前的电位），此时氧化金的还原电荷将抵消金氧化的电荷，氧化金的还原比氧化快。因此为了完成背景补偿（校正），电位E4（-0.05V）的时间不必像电位E3那样长，总的积分时间约为450ms（E3为 290ms，E4为140ms）。在积分完毕后，立即将电位降至清洗电位E5（-2V），对电极进行清洗，避免电极被过度氧化侵蚀，然后迅速升高电位至活化电位E6 （+0.6V），再立即回到初始电位E1，从而完成一次积分周期。高电位时电极上形成的金氧化物在低电位时被还原，而氨基的氧化反应是不可逆。因此，金电极自身的氧化反应产生的信号被极大抵消，总的信号值决定于高低电位之间的电流积分值。 Time(ms) Pot. Integ 0.00 -0.20 0.04 -0.20 0.05 -0.05 0.11 -0.05 Begin 0.12 +0.28 0.41 +0.28 0.42 -0.05 0.56 -0.05 End 0.57 -2.00 0.58 -2.00 0.59 +0.60 0.60 -0.20 图2 测定氨基酸的积分安培电位波形图 Fig 2 Integrated amperometry waveform. used to detect amino acids. 3 应用样品的前处理方法在氨基酸分析中具有重要的地位。由于能够直接用于分析的样品有限，样品中的氨基酸大多以蛋白质，多肽的形式存在，需要进行前处理，包括样品的提取，纯化和水解。表3列出了常用的4种水解方法[6]，这些方法处理的样品都能用美国 Dionex公司的AAA-直接氨基酸分析系统分析。 表3 氨基酸样品分析的水解方法 Table 3 Hydrolysis Procedures of Amino Acids Analysis 方法Procedure 适用范围Comments 6M HCl 介质中110°C水解6~72小时 最常用的水解方法缺点：丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸和甲硫氨酸的回收率较低；色氨酸被破坏。加入还原剂巯基乙酸，可减少甲硫氨酸和色氨酸的损失过甲酸氧化/6M HCl 用于测定含硫氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸 4M 甲基磺酸中110°C水解22小时 条件温和，可用于测定色氨酸 4.2M NaOH 中110°C水解18小时 色氨酸测定的首选方法，可以直接与AAA-Direct方法兼容，而对茚三酮衍生化方法，则需要对样品进行中和或稀释，中和产物NaCl干扰衍生化反应，样品稀释倍数受茚三酮衍生化方法灵敏度的限制。 美国Dionex公司发展的氨基酸直接分析方法的色谱条件如下：分离柱：AminoPac PA10和PG10 淋洗液：E1=纯水，E2=250 mM NaOH，E3=1.0 mM NaAc 流速：0.25mL/min 进样体积：10mL 温度：30?C 检测方式：积分脉冲安培检测器（IPAD），Ag/AgCl 参比电极，金工作电极。图2为常见氨基酸的标准混合溶液色谱图。Dionex公司的AAA—直接氨基酸分析仪为PEEK全塑系统，该公司专门研制的用于分析氨基酸的高效阴离子交换柱 AminoPac PA10在pH 0~14及有机溶剂中稳定。此方法已广泛用于蛋白质和肽的水解产物，食品和饮料等样品中氨基酸的分析。Alan P. Clarke 等人[7] 对20多种基本氨基酸和胶原蛋白，胎球蛋白的水解物进行分离测定，并且与经典的茚三酮光度检测法进行比较，结果无显著差异，见表4。Petr Jandik 等人 [8]对细胞培养基与发酵肉汤中氨基酸，部分糖类化合物进行了分析监测。特别要提到的是，这种方法简化了色氨酸等的检测，因为用HCl水解样品时，色氨酸会分解，而用NaOH水解时，由于柱前或柱后衍生反应的需要，必须经中和后方可进行衍生反应和进样分析，而用Dionex的直接分析方法，用NaOH水解后可直接进样。另外该法还可以一次进样同时分析氨基酸，氨基糖和碳水化合物。 表4 用积分安培法和茚三酮光度法测定胶原蛋白中氨基酸结果的比较 Table 4 Comparison of Amino Acid Concentrations for Collagen Measured by Integrated Amperometry and Ninhydrin Methods 氨基酸Amino Acid 积分安培法Integrated Amperometry 茚三酮光度检测法Ninhydrin mole% pmol mole% ArgHydroxyl LysLysAlaThrGlyValHydroxyproSerProIleLeuHisP heGluAspTyr 1432074313488605826490321316615381 7811911 5.30.82.811.61.831.82.19.8 3.4 11.9 1.2 2.4 0.6 1.4 6.6 4.4 0.4 5.80.8 2.7 11.0 1.7 32.7 2.1 9.0 3.3 12.4 1.2 2.5 0.5 1.3 7.6 4.7 0.4 参考文献： 1. Spackman, D. H.; Stein, W. H.; Moore, S. Anal. Chem. 1958, 30, 1190-1201. 2. Cohen, S. A.; Michaud, D. P. Anal. Biochem. 1993, 211: 279-287. 3. Installation Instructions and Troubleshooting Guide for the AAA-Direct Amino Acid Analysis System. Document No. 031481; Dionex Corporation. 4. Polta, J. A.; Johnson, D. C. J. Liq. Chromatogr. 1983, 6: 1727-1743. 5. Welch, L. E.; LaCourse, W. R.; Mead, D. A.; Johnson, D. C. Anal. Chem. 1989,61,555- 559. 6. Dionex Corporation, Technical Note 50. 7. Alan P. Clarke, Petr Jandik et al., Anal. Chem. 1999, 71:2774-2781. 8. Petr Jandik, Alan P. Clarke, J. Chromatogr. B 1999, 732: 193-201. The Principle and Application of Amino Acids Analysis System Abstract: A new method to analyze amino acids by ion-exchange chromatography – integrated pulsed amperometric detection is introduced. The principle and application of this method are discussed in detailed. Comparing with traditional method, analysis of amino acids by this new method can be performed direct without post-column and pre-column derivatization. The new method has high sensitivity with the detection limit under 1 pmol and the linearity over three orders of magnitude for most common amino acids. Key words: Amino acids, HPIC-IPAD.