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发酵工艺学原理

上一篇 / 下一篇 2009-02-28 20:32:01 / 个人分类：专业资料

二、GA生物合成的内在因素

从上图可以看出，菌体要在葡萄糖含量10%以上的培养基上，合成5%以上的谷氨酸，是一种不正常的现象，显然GA产生菌必须具备以下条件：

1.α—KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失

这是菌体生成并积累α—KGA的关键，从上图可以看出，α—KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在α—KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由α—KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内α—KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，α—KGA才得以积累。

2.GA产生菌体内的NADPH的在氧化能力欠缺或丧失

（1）如上图所示，NADPH是α—KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联的。

（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制α—KGA的脱羧氧化有一定的意义。

3.产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶。

该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA 发酵的首要条件。关于该酶的酶活性的调节后述。

4.菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性

α—KGA + NH4+ +NADPH == GA + NADP

L—谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强

该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联，反应机制如下：

α—KGA NADPH α—KGA

GA NADP 异柠檬酸

三、GA 生物合成的最理想途径

上述涉及到的GA生物合成途径很多，那GA 生物合成由哪几条途径合成是最为理想的呢？

通过比较来说明这一问题：

1. 在前述GA 合成所必需的条件的基础上（……，封闭乙醛酸循环）体系不存在CO2固定反应，则有：

3/2Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 + 丙酮酸

CO2

乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A

柠檬酸（DCA循环封闭）

谷氨酸

则有：

3/2 C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + 4 CO2 （来自何方？提问）

产率：147 /（180*3/2） == 54.4%

2.在前述GA 合成所必需的条件的基础上（……，封闭乙醛酸循环）存在CO2固定反应，则有：

Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸

CO2

草酰乙酸

（草酰乙酸

羧化酶）

乙酰辅酶A + C4二羧酸

苹果酸

（苹果酸激酶）

柠檬酸（DCA循环封闭）

谷氨酸

则有：

C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + CO2 （来自何方？提问）

产率：147 / 180 == 81.7%

可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。

在许多微生物发酵的过程中，通常需要检测反应器尾气的组成，特别是尾气中CO2的含量，其主要目的就在于分析产物合成期间菌体的代谢途径，有利于指导生产。

在GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径：

（1）磷酸丙酮酸羧化酶的作用下

磷酸丙酮酸 + CO2 + GTP == 草酰乙酸 + GDP

(2) 苹果酸合成酶的作用下

丙酮酸 + CO2 +NADH === 苹果酸 + NAD

需要Mn+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+

实际上，发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应，体系也不可能完全不存在CO2固定反应，因此，GA 发酵的糖酸转化率应在：54.4%——81.7%。目前，国内的GA生产企业的糖酸转化率通常都在50%以内：

（1）企业计算的糖酸转化率是把GA 发酵前期菌体增殖时期消耗的葡萄糖计算在内，而我们所计算的不包括这一部分葡萄糖，通常这一部分糖占总量的20%左右，当然与企业的技术水平有关。

（2）TCA 循环也不可能完全封闭；α—KGA也不可能完全转化为GA；生成的GA也不可能完全分泌的细胞外；发酵液中还存在一定的残唐，通常在0.5%——0.7%之间。

无论如何，提高GA的潜力仍然是很大的，具体表现在：

（1）强化CO2固定反应，具体措施：Mn+，生物素？

（2）控制溶氧浓度是非常重要的

低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化……

高的溶氧浓度，则NADPH 有被氧化的可能，……

四、生物素对GA发酵的影响

GA 产生菌大都是生物素的营养缺陷型，即：VH-，在发酵过程中要严格控制其浓度，主要是生物素对发酵的影响是全面的，分述如下：

1.生物素对糖代谢的影响

一方面，VH对于糖酵解有促进作用，对丙酮酸的有氧氧化——乙酰辅酶A的生成也有促进作用，但两者的促进作用不一样，对前者大一些，这样培养基中如果有较丰富的VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸声称，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。

另一方面，可以通过控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。前述，封闭乙醛酸循环对于GA发酵的重要性，那么，如何封闭乙醛酸循环呢？

DCA循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表明，该酶受以下几个因素的影响：

为醋酸诱导

受琥珀酸的阻遏，其活性受琥珀酸的抑制

（受到Glucose的阻遏？）

这样，当VH缺乏时：

（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于VH对TCA循环的促进作用)，则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；

（2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；

两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。

2.生物素对氮代谢的影响

由以上分析可知，当VH缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱，那么相反，当VH丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则DCA 循环正常进行，DCA循环的进行，一方面提供了大量的“中间性产物”，另一方面，菌体的能和水平得到提高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。这样的结果是，有利于菌体的增殖和生长，则GA的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的“只长菌，不产酸”的现象。

以上分析说明，GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。

3. VH对菌体细胞膜通透性的影响

细胞膜通透性的调节对于GA 发酵时非常重要的，正如前述，当菌体进入产物合成期时，开始有GA的产生，这是如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可以解除GA对L—谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用，从而使现由

Glucose GA的高效率转化，反之，如果……。可见，改善细胞膜通透性的重要性，如何进行呢？

通常谷氨酸发酵采用的菌种都是VH-，而VH又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制VH的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性的调节。

VH对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。生物体内脂肪酸的合成途径如下：

葡萄糖丙酮酸 + 丙酮酸

乙酰辅酶A 　　乙酰辅酶Ａ

乙酰辅酶A羧化酶 CO2

　　　　　　　　 CO2

　　　　　　　丙二酰辅酶A

丙二酰辅酶A CO2

其中，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A的酶是乙酰辅酶A羧化酶，该酶的辅酶是VH，VH在此反应过程中起到传递CO2的作用。当培养基中VH的浓度较低时，细胞膜的合成就会受影响。

培养基中生物素限量时，胞内AA 92% 胞外

培养基中生物素丰富时，胞内AA 12% 胞外

五GA发酵的外在因素

GA发酵是一个典型的代谢控制发酵，固然有其内在的菌体特性，诸如：？（提问），但是正如任何事物发展的基本规律一样，外在因素仍然有重要的作用，对于GA的发酵也是一样。

1.供氧浓度

过量：NADPH的再氧化能力会加强，使α—KGA的还原氨基化受到影响，不利于GA 的生成。

供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。

2. NH4+浓度

（1）影响到发酵液的pH值

（2）与产物的形成有关：

过低，不利于α—KGA的还原氨基化

过高，产生固安酰胺（？，缺点？）

NH4+的供给方式：

（1）液氨

（2）流加尿素，条件和优缺点？

副反应：

3.磷酸盐

过量：（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等……

（2）产生并积累Val，

途径如下：

Glucose 丙酮酸 + 丙酮酸

（焦磷酸硫胺素，TPP）

活性乙醛

α—乙酰乳酸

Val

Val（1）可以抑制葡萄糖丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止

（2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率

（3）发酵液中的Val存在，严重的影响GA 的结晶、提出。

§4-4 Lys的生物合成机制与代谢调节

一、行业简介

Lys是人体所必需的8种氨基酸之一，（Thr Val Ieu Lieu Phe Met Lys try，苏、氨酸、亮、异亮、苯、蛋、赖、色）

发酵法赖氨酸的生产最早起源于日本，我国80年代中期相继有赖氨酸的发酵生产厂家，山东海洋还有生产厂家。80年代赖氨酸食品曾经非常盛行，那时人们普遍认为，我国人民的膳食结构中Lys 的摄取量是不够的，因为Lys主要来自于动物蛋白质，而我国饮食结构中的蛋白质的主要来源是植物蛋白，从这个意义上讲，适量的补充Lys是科学、合理的。然而，事物的发展是有其规律性的，……。现在，Lys食品非常少，一方面是由于人们的饮食结构发生了变化……；另一方面，人们对于基酸的摄取科学知识增加了……。现在，Lys主要作为添加剂用于饲料，人们发现动物缺乏……。

我国的Lys生产与国外的差距主要表现在：

（1）菌种性能的差异，Lys 是菌体代谢过程中的中间性产物，但不是主链上的产物，其生成机制很复杂，对菌种的要求很高，国内菌种的产酸水平为：35—55g/L，转化率为：20—25%。远低于国外的生产水平。

（2）提出率较低。

（3）生产规模较小。

二、赖氨酸的生物合成机制

目前已知的赖氨酸生物合成途径有两条，以细菌类为主的一条、以酵母菌为主的一条合成途径。由于酵母菌体内的赖氨酸的生物合成产率要低于细菌类的，因此，目前的赖氨酸发酵生产都是采用细菌为生产菌种。在微生物发酵过程中，通常细菌和酵母菌两者的各有优缺点，试比较如下：

细菌类发酵与酵母菌发酵的比较：

优点：（1）菌体体积较小，相对增殖所用的底物较少，产率高。

（2）细菌的繁殖速度快，在合适的生长条件下，其繁殖速度只有几分钟，而酵母的增殖速度最少在一个小时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。

（3）细菌的细胞膜的通透性易于调节，对于胞外产品，可以通过其细胞膜的通透性控制来促进产物的分泌，例如，GA的发酵；对于胞内产物，其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎。

缺点：（1）细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于产物的结晶提出，或产物就是菌体或菌体内的胞内物），细菌比酵母菌难以分离。

（2）细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格，发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求也很高，这就增加了细菌发酵的生产成本。

（3）细菌发酵易感染噬菌体，……

细菌赖氨酸发酵使用的菌种通常有两种类型，分述之：

1、大肠杆菌中的Lys的生物合成与代谢调控：

大肠杆菌中的Lys生物合成途径要比黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌的代谢调控要复杂，其过程如下：

Glucose

EMP

丙酮酸

草酰乙酸

Asp

(天冬氨酸激酶AK，同功酶)

天冬氨酸磷酸（asp-p）

天冬氨酸β-半醛

（同功酶）

二羟吡啶羧酸

高丝氨酸（Hos）

Lys

珀酰高丝氨酸 O-磷酸高丝氨酸

Met Thr

大肠杆菌赖氨酸代谢特点：

关键酶：天冬氨酸激酶是一个同功酶，分别受三个代谢产物的抑制，这三个终产物分别是：Lys、Met和Thr，只有当这三个代谢产物同时过量时，Asp激酶的活性才能完全被抑制。

同功酶：催化同一反应，但其活性受不同代谢产物体调节的酶。

根据上述代谢特点，要使菌体合成并积累Lys，可以选育Hos-，这样的话，既可以解除β—天冬氨酸的代谢支路，使代谢流向Lys的方向进行，提高了从底物葡萄糖到产物的转化率；更重要的是由于Hos-，使得代谢过程中不可能产生过量的Met、Thr，尽管产生了大量的Lys，Lys可以抑制关键酶——天冬氨酸激酶1，但是天冬氨酸激酶2、3的活性由于Met、Thr的限量，并没有受到抑制，也就是说，天冬氨酸β—半醛，仍可以大量的生成，这就保证了Lys的生物合成途径的畅通无阻。

2.黄色短杆菌Lys生物合成的调控

Glucose

EMP

丙酮酸

草酰乙酸

Asp

(天冬氨酸激酶，AK)

天冬氨酸磷酸（asp-p）

天冬氨酸β-半醛

二羟吡啶羧酸高丝氨酸

O-磷酸高氨酸

Lys

Met

O-琥珀酰高丝氨酸

Thr

黄色短杆菌与大肠杆菌（E.coli）的区别：

（1）天冬氨酸激酶（AK），在黄色短杆菌中是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys、Thr的协同反馈抑制，？

协同反馈抑制，就是该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。

（2）黄色短杆菌中，存在两个分支点的优先合成机制，如图所示（），即优先合成Hos，然后再优先合成Met，当Met过量时，阻遏：催化Hos 琥珀酰高丝氨酸所需要的酶的合成（即，琥珀酰高丝氨酸合成酶），使代谢流向合成Thr的方向进行，当Thr过量时，反馈抑制：Asp-β-半醛 Hos所需要的酶的的活性（即高丝氨酸脱氢酶），使代谢流向Lys的合成上。

根据以上代谢特点，利用黄色短杆菌生产Lys，需要选用Hos-，

其意义在于：

（1）解除了Hos的优先合成机制，阻断了代谢向Met、Thr的方向进行，节省了原料，可以使Asp-β-半醛这个中间代谢产物全部转入Lys的生物合成上。

（2）在培养基中限量的供给Met 、Thr（或者Hos），对于AK酶活性的调节有着重要意义。因为AK酶是一个协同反馈抑制的变构酶，限制了其中某一个抑制物（Thr），则Lys的浓度再高，也不会影响到AK酶的活性，那么，代谢一直向着赖氨酸合成的方向进行，使得产物的合成畅通无阻。

尽管，从理论上讲，选育Hos- 进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给Thr，则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制，实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用（课本，第73页，表6—1）。因此，对于黄色短杆菌的Lys发酵，仅仅选育Hos- 是不够的，但是为了高效率的转化Lys，需要解决这一问题：

是该酶（AK）脱敏（就是该酶具有抗反馈抑制或阻遏的能力），如何使其脱敏呢？

可以选育结构类似物抗性突变株？（X r）

(1)S-L-半胱氨酸抗性突变株 AECr

(2)γ-甲基赖氨酸抗性突变株 MLr

（3）L-赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株 LysHxr

（4）苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株 ThrHxr

使用黄色短杆菌进行赖氨酸的发酵，还可以选育具有双重标记的营养缺陷型突变株（Met- + Thr-）,其本质上和Hos- 是一样的，但双重标记的营养缺陷型突变株的优点是：遗传性质稳定，恢复突变的几率少。

§4-5 抗生素的生物合成机制与代谢调节

一、次级代谢与初级代谢的关系

1.基本概念

初级代谢：是指微生物合成它们生长所必需的物质的诸如：糖、氨基酸等以及由这些化合物形成的高分子物质如：多糖、蛋白质、核酸等的代谢，称之为初级代谢。那么，这些化合物统称之为：初级代谢产物。

次级代谢：是指微生物在生长后期进行的与他们的生长无明显关系的代谢，这一类的物质统称之为：次级代谢产物。例如：抗生素、激素、某些酶制剂等。

其特点为：结构比较复杂，其合成的代谢过程比较复杂，大部分的合成机制到目前为止，尚没有搞清楚。

2.从菌体代谢途径上看两者之间的关系

许多抗生素等次代谢产物的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切关系的，如下图所示。

从下图可以看出，许多物质处于代谢的分叉点上，例如：CH3CO-SCoA，是葡萄糖糖经HMP、 EMP生成的中间物质，经羧化后可形成丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A可用于脂肪酸的合成上，进而又可经多次重复缩合、环化等形成四环类或其他抗菌素等次级代谢产物，而CH3COSCoA又可以进入TCA循环。这类物质称之为：分叉中间体。如：丙酮酸、乙酰辅酶A、草酰乙酸等

这些个分叉中间体把微生物的次级代谢和初级代谢紧密地联系起来。

Glucose

C3 丝氨酸甘氨酸

莽草酸 丙酮酸 Val 次级代谢产物

芳香族氨基酸

芳香类次级代谢产物

丙二酰辅酶A 乙酰辅酶A

脂肪酸

次级代谢产物

TCA循环

草酰乙酸、α-KGA 谷氨酸

Met 天冬氨酸次级代谢产物

次级代谢产物

3.从代谢调控上看两者之间的关系

两者都分别受到微生物的代谢调节控制，但在代谢调节上，两者又是相互影响的。研究表明：当抗生素合成的初级代谢途径受到控制时，即，Val对α—乙酰乳酸脱氢酶产生反馈抑制时，青霉素的生物合成必然受阻。从这种意义上讲，研究次级代谢的调节与控制要比初级代谢复杂得多，因为初级代谢的控制直接影响到了次级代谢。

以青霉素的合称为例：

青霉素的合成如下：

Glucose 丙酮酸 + 丙酮酸

（焦磷酸硫胺素，TPP）

活性乙醛

α—乙酰乳酸脱氢酶

α—乙酰乳酸

Val

青霉素

实验表明：选育α—乙酰乳酸脱氢酶对Val不敏感的菌株，则可以提高青霉素的产率。

二、抗生素的生物合成途径：

抗生素的生物合成途径是比较复杂的，目前有许多抗生素的生物合成途径尚不清楚，还有许多是属于推测性的。这一部分的内容不作介绍，有兴趣的同学可查阅相关书。

重点介绍下一个内容：

三、抗生素的代谢调节机制

微生物体内有着微妙而科学代谢调节系统，在微生物体内存在多种生化反应，也就有多种的酶参入，这些酶的活性很大一部分是受到其代谢产物的调节与控制的，但是调节与控制的方式是不同的。总体上讲，存在两大类酶活性调节方式：抑制与阻遏

抑制：酶活性的抑制，对于多酶体系，则有：协同、增效、同工酶等

阻遏：酶合成的阻遏

前者是对酶活性的抑制，是被动的调节；后者是对酶的生物合成的阻遏，是主动的而有效的。

在抗生素的生物合成过程中，由于存在极为复杂的生物化学过程，也就存在极为复杂的调节与控制机制，这里只从大的方面谈一下：

1.菌体由生长型到产物积累性的转变

初级代谢在大多数的情况下，产物的合成与菌体的生长是同步进行的（GA酸等除外），而次级代谢产物的合成只有在菌体完成增殖并停止生长以后，才有产物的生成。对于分批（batch）发酵过程，细胞在生长期，没有产物的形成，这一时期，参入次级代谢的酶系处于抑制状态，一旦细胞生长结束，则这些酶的活性被激活或者其合成机制被激活（阻遏被解除），这时次级代谢产物开始合成。可见，菌体实现从生长型到产物积累型的转变，是次级代谢发酵成功的关键，那么，菌体是如何完成这种转变的呢？

目前，由于基础理论的研究不够，引起上述转变的机制尚没有搞清楚（GA发酵研究得很清楚，它是初级代谢产物，生成的途径、机制有关的酶系也很清楚，但是大多数次级代谢产物的合成途径尚没有搞清楚，涉及到的酶系非常复杂……）因此，在次级代谢发酵工艺中，来完成这种转变的方法也没有固定模式，不同的发酵，采用不同的方法：

（1）在大多数的抗菌素发酵过程中，控制培养基中的特定的营养成分，当微生物达到生长平衡后，由于培养基中的特定的营养成分的减少，微生物停止生长，微生物群体则实现了从对数生长型到产物积累型的转变，这时，从微观的角度看，微生物的代谢流发生了转变；从宏观的角度看，微生物对于环境的要求也发生了转变（比如：溶氧水平的升高，pH值的改变等），其本身的形态也会发会发生变化，例如：庆大霉素的发酵（放线菌）在菌体的增殖期，菌丝体细长，而进入庆大霉素的合成期，菌丝体变得粗短，……

（2）在酶制剂的发酵生产中，引起上述变化的因素仍然是不确定的，大多是情况下，是由于限制性营养成分浓度降低所致。

本人对地衣芽孢杆菌的耐高温α—淀粉酶发酵的研究研究发现，某些外界条件也可以引起微生物的代谢流的转变，例如：在菌体的增殖期突然停电2小时，停电即意味着发酵液的溶氧浓度DO=0，其结果是，来电后恢复到原来生物反应器的运行状态，但是菌体不能够继续增殖，而是转变成了产物积累型开始合成耐高温α—淀粉酶。这种转变，在微观上仍然是代谢流的转变，而在宏观上，仍然能够表现出菌体形态的变化，由原来生长期的粗短型，转变成细长。这与同样是细菌发酵的GA酸发酵不同，后者当菌体从生长型转变成产物积累型后，其形态则是由细长转变成粗短型。

2.磷酸盐调节

磷酸盐对抗生素发酵的影响具有双重性，主要表现在：

（1）高浓度的磷酸盐对抗生素的生物合成具有抑制和阻遏作用，例如：链霉素、金霉素、四环素等，现已发现有32种抗生素受到磷酸盐的抑制和阻遏。

(2)磷酸盐浓度低时，菌体生长速度缓慢，生长量（菌体浓度）也不够，不利于抗生素的生物合成。

高浓度的磷酸盐对于抗生素合成的影响机制有以下两种情况：

（1）抑制或阻遏抗生素合成途经中的某些关键酶。

已有许多研究证明：当磷酸盐的浓度≧10mmol/L时，菌体内与抗生素合成有关的酶的活性将受到抑制。

（2）高浓度的磷酸盐可以改变菌体的代谢途径。

分析磷酸盐对EMP途径、对TCA循环的影响（促进作用），带来的……；

高浓度的磷酸盐改变MEP：HMP，不利于HMP的进行，当然也不利于以HMP途经中的中间产为前提的次级代谢产物的生物合成。例如：过量的磷酸盐会减少四环素的生物合成，是由于HMP途经中的戊糖浓度降低造成的。

3. NH4+浓度

在抗生物的发酵过程中，培养基中如果存在容易被利用的无机氨态氮，例如：（NH4）2SO4、NH4CL等，或其他可以被迅速利用的氮源，则对抗生素的合成有强烈的抑制作用。

NH4+对于抗生素合成的抑制作用机制目前尚没有搞清楚，有人认为，NH4+可以强烈的刺激菌体的生长，进而影响了菌体从生长型到产物积累性的转变，影响了抗生素的生物合成。发酵中期当微生物群体进入产物合成期时，如果向发酵液中流加氮源，则可以造成发酵逆转，使微生物群体返回到生长期而停止产物的合成，这种现象在次级代谢产物发酵过程中是非常普遍的。

发酵逆转 耐高温α—淀粉酶发酵中，流加：G、GA，停电等

§4-6 代谢产物的过量生产

所谓代谢产物的过量生产就是指微生物在一定的条件下或者说在一定的外界条件下，积累并分泌过量的代谢产物。例如：酵母菌在厌氧的条件下积累并分泌大量的乙醇，GA产生军在一定的条件下积累并分泌大量的谷氨酸……

众所周知，微生物细胞内有着非常完善的代谢调节控制机制，使细胞内复杂的生物化学反应可以高度有序的进行，在其生长过长中，能量的利用、各种物质的消耗与合成都是非常合理而经济的，需要多少合成多少，不需要的则不合成，因此，微生物的过量生产就意味着改变了它本身的这种调节机制，这正是现代发酵工业要研究的重要内容之一。

本节分为两个部分分别谈一下如何提高代谢产物的方法，本章前述的几个物质的发酵生产，各有不同的方法，本节实质上就是对前述内容的系统总结。

一、提高初级代谢产物产量的方法

初级代谢产物不同于次级代谢产物，微生物对于初级代谢的调节控制要比次级代谢控制要强烈的多，因此度对于提高初级代谢产物产量的方法不同于……

1.使用诱导物

对于许多酶类的发酵，特别是淀粉、蛋白质的水解酶，其大部分是诱导酶，对于这一类的酶类的发酵，向培养基中添加诱导物，可以促进酶的合成与分泌，有利于提高产量。

但是，诱导物往往是比较昂贵的，经济上并合算。例如：耐高温α—淀粉酶诱导物是乳糖，如果使用乳糖作为诱导物的话，生产成本很高，经济上是不可行的，乳糖作为诱导物通常在……。在实际生产中要选择一种廉价的、高效的诱导物是很困难的，通常选用诱导物的结构类似物是最理想的，因为结构类似物不能够被诱导产生的酶水解，可以在培养基中一直保持一个较高的、稳定的浓度，能够持续发挥诱导作用，从而得到较高的酶活。但结构类似物的选育？到目前为止，在生产上尚没有使用诱导物成功的例子。那么，对于这一类型的发酵，如何提高……？

2.选育组成型突变株

诱导机制：目前最清楚的是大肠杆菌的乳糖操纵子

无诱导物：

产生有活性的阻遏蛋白，结合到操纵基因上，使NDA中的结构基因不能翻译（蛋白质），酶不能够合成。

R---调节基因，regulatiopn gene

P---启动子，Promotor

O---操纵基因，operation gene

S---结构基因，structure gene

有诱导物：

产生有活性的阻遏蛋白，

阻遏蛋白 + 诱导物

阻遏蛋白无活性，不能结合到操纵基因上， NDA中的结构基因正常翻译（蛋白质），酶正常进行。

如果，通过化学的、物理的或者生物的方法，使上述操纵子中的调节基因发生突变，使之不能够合成这种阻遏蛋白，或者合成的阻遏蛋白无活性，或者突变发生在操纵基因上，那么，酶的这种诱导作用就解除了，酶的合成畅通无阻，这种突变株称之为，组成型突变株。

组成型突变株是微生物发酵领域，生产具有诱导机制的代谢产物行之有效的方法。

组成型突变株的选育方法？（可以作为作业）

3.解除分解代谢阻遏

分解代谢阻遏：当培养基中同时存在多种可供利用的底物时，分解利用某些底物的酶往往被最容易利用的底物所阻遏。

分解代谢阻遏，又称之为，葡萄糖效应。微生物细胞的这种机制保证了细胞只有在利用某些底物时才合成与之有关的酶类，而且保证了多种底物同时存在时，优先利用最好的底物，就像嘴馋的人一样，这对于细胞来讲无疑是极有意义也是极为合理的。

例如：

把E.coli培养在Gluose + 乳糖的Medium 中，其大肠杆菌的生长明显存在两个对数生长期。原因是E.coli在利用Glucose时，分解利用乳糖的酶——β—半乳糖苷酶的合成受阻，只有当Glucose被利用完以后，上述这种对β半乳糖苷酶合成的阻遏作用随之消失，于是出现了菌体利用乳糖进行生长的第二个对数生长期。

给生产带来的危害：

在正常的发酵过程中，微生物群体从完成了生长型到产物积累型的转变后，大量的产物开始生成，底物源源不断地转化成产物，但是当培养基中存在易引起分解代谢阻遏的物质时，菌体可能出现二次生长，微生物群体又回到了生长状态，即发生了前述的发酵逆转，这显然是不利于提高产量的。

生产中克服分解代谢阻遏的措施：

1抗性突变株的选育：

从遗传学看，如果调解基因发生突变，使阻遏蛋白失活；操作基因发生突变，不能与阻遏蛋白结合，那么这种分解代谢阻遏就不存在，有利于代谢产物的过量生产。

2生产中避免使用有阻遏作用的C源、N源

目前已知的不易引起分解代谢阻遏的C源：乳糖、有机酸；

目前已知的不易引起分解代谢阻遏的N源：黄豆粉，

黄豆粉之所以不易引起分解代谢阻遏，是因为黄豆粉是一个颗粒状的原料，其中的蛋白质存在于颗粒中，起到缓释的作用。

3流加C源、N源

缓慢的流加C源、N源，使发酵培养基中的C源、N源一直保持在一个均匀的、较低的水平，则有利于消除分解代谢阻遏的出现，可以明显的提高产量。

3.解除反馈抑制：

末端产物对于微生物代谢链中的几个关键酶通常都存在着反馈抑制作用。解除这种反馈抑制的方法有：

1抗性突变株，又称为结构类似物突变株。

例如： G GA Arg

根据上述谷氨酸棒杆菌中的精氨酸Arg的代谢途径，如果要积累Arg，使Arg过量生产，必须解除Arg对GA N---乙酰谷氨酸这一酶促反应的反馈抑制作用。

最有效的方法是选育抗性突变株，Argr

2对于分枝代谢，可以选育营养缺陷型突变株。

前述的Lys的发酵就是这样一个典型例子。

4.防止突变株的回复突变：

经诱变而产生的各种各样的突变株，在生产过程中易于发生回复突变，也就是说其存在一种遗传学上的不稳定性。解决这种恢复突变的方法：

1选择具有双重标记的突变株。

例如，在Lys的发酵中选育具有 Hos- 和Met- 的双重标记菌株，可以提高其稳定性。

2对于抗性突变株。

可以在培养基中加入适量的结构类似物，以防止已经发生回复突变株的抗性突变株的增殖。

5.细胞膜透通行的调节：

在GA代谢部分讨论过细胞膜透通性对于微生物发酵工业的意义。细胞膜对于物质的进入（透通与排泄）是有高度的选择性的。其输送系统的这种高度的选择性，这主要取决于其透性酶的活性与结构。

改变细胞膜透通性的方法主要有：

1改变膜的组成与结构，使之成为不完整的细胞膜。

2破坏细胞壁的合成，使之不能合成完整的细胞壁，由此，细胞膜由于缺乏细胞壁的机械保护作用可以改变其渗透性。

3透通性酶活性的调节与控制：

上述表明，细胞膜对于要输送的物质具有高度的选择性，这种高度选择性与透通性酶的活性、结构有着直接的关系，而透性酶与其他酶相同，也有着自己的调节与控制机制。研究这种机制，有利于提高微生物的代谢产物的过量生产。

以上是从微生物的代谢机理方面，或者说从微观的角度，论述了提高微生物初级代谢产物的具体方法和措施，这些措施可以在同一种微生物的发酵中同时使用，也可以单独使用某一种方法。但是，在微生物的工业发酵过程中，提高微生物初级代谢产物，仅仅考虑上述的微观的方法是远远不能够实现大规模的工业化生产，还需要从工程的角度上：

1强化传质包括：底物和排泄的物质，氧的传递。

2控制生物反应的均一性。包括：底物浓度，H+浓度、氧化还原电位、温度等。

③控制泡沫的的生成与消除。

这就是下一章我们要讨论的内容，后述。

二、提高次级代谢产物的方法：

初级代谢产物与次级代谢产物两者是有着明显的区别的，其区别除了前边叙述的，

对于微生物生长的作用不同

产物的结构不同

产物形成的时间不同

除了上述差别此外，对于微生物的过量生产，其培养条件也不相同。初级代谢产物的形成一般只需简单的营养条件，在化学成分确定的培养基中即可生成。例如：Yeast的酒精发酵，柠檬酸发酵、甘油发酵、GA发酵等。而次级代谢产物则需要复杂的营养条件，通常要供给成分复杂的天然物质时才能形成，而且次级代谢产物形成的条件要求特殊，尤其是过量生产，其培养基不同，培养过程中的条件控制也不相同。

通常，次级代谢产物是在菌体生长高峰期后，Medium中的C、N、P、S等基本耗完以后，与这些物质代谢有关的酶系的活力趋于下降，这时，与次级代谢产物形成有关的酶系逐渐出现，次级产物开始形成。在发酵过程中，研究如何使次级代谢产物进入分化期，即如何诱导or引发次级代谢产物的形成，是目前发酵领域研究的热门课题之一。

这里介绍几种提高次级代谢产物的方法：

1、补加前体（前驱物质）：

在合成途径已基本清楚的条件下，向发酵培养基中补加前体，可以有效的提高次级代谢产物的产量。

例如：在青霉素G的发酵法生产中，补加前体物质，苯乙酸or其衍生物，可以明显的增加青霉素的产量。这是因为，在青霉素的发酵生产过程中，苯乙酰—CoA是青霉素G生物合成的限速性因子，受到许多代谢控制，添加苯乙酸or其衍生物后，可以提高苯乙酰CoA的浓度，解除了苯乙酰—CoA对于青霉素G合成的限速，从而提高青霉素的产量。

补加前体的有两个条件：

①前体是产物形成的限速因子，其合成受到众多的控制。

②必须已知其代谢途径，且补加的前体物质对于M体内其他酶系无抑制作用，否则，影响到了菌体的其他代谢，如：产能代谢等，仍然不能提高次级代谢产物的产量。

2、解除分解代谢阻遏：

何为分解代谢阻遏？提问这一概念。抗性突变株

对于初级代谢产物的过量生产，前述的方法是：控制培养基的组成

流加技术

对于次级代谢产物的过量生产，使用的方法是：

流加技术

控制培养基的组成

C源：使用缓慢利用的原料，寡糖、多糖、液化淀粉

N源:豆粉、蛋白胨等