豫豆-25 11S球蛋白结构与凝胶、乳化特性关系的研究

豫豆-25 11S球蛋白结构与凝胶、乳化特性关系的研究

（摘 要）

周瑞宝 尹春明 张红娟

（郑州工程学院蛋白质资源研究所，郑州  450052）

应用四号溶剂脱脂低温脱溶的工业和实验室规模制备的豫豆-25低温脱脂豆粕为原料，结合先进的制取分离纯化技术，提取了纯度达到92.3％的豫豆-25 11S球蛋白。并以此全面分析了pH值、离子强度I、温度T等主要因素对豫豆-25 11S球蛋白的溶解性，乳化能力EC和乳化稳定性Es的乳化特性的影响，以及豫豆-25 11S球蛋白凝胶质构特性与蛋白质浓度、加热时间、加热温度和pH值的关系的研究。

实验结果表明制备的11S球蛋白在离子强度0.1的磷酸盐缓冲液中，pH4.4~6.4是其溶解度最小的范围。豫豆-25 11S球蛋白形成凝胶的最低蛋白浓度为4%，蛋白浓度提高，凝胶硬度、脆度及粘性相应增加，增加趋势在蛋白浓度大于11%后尤为显著；加热时间与凝胶的质构特性有较强的相关性，适当的加热时间是形成成熟的，具良好质构性能的凝胶的必要条件之一，豫豆-25 11S球蛋白要形成成熟的凝胶，加热温度需在80℃以上，加热时间达到30分钟，随着加热时间的增加，凝胶的硬度、粘性增加，但30min后增加缓慢，而在20~50min的时间范围，脆度变化不大；pH值对豫豆-25 11S球蛋白凝胶的形成及质构特性影响较大，酸性条件下的凝胶与碱性条件下的有较大的差异，pH从7.5~10.5，凝胶的硬度、脆度和粘性变化不大，pH4.15的凝胶的三个评价指标均高于碱性条件下的凝胶，由于11S球蛋白在未加热之前即发生了部分解离，pH﹤3时11%11S球蛋白未形成凝胶，蛋白溶液pH4.4~6.4范围为其等电点范围，它也无法形成凝胶，而是蛋白质沉淀聚集于下层。扫描电子显微镜（SEM）观察显示：不同pH条件下，11S球蛋白凝胶的微观结构具有明显的差异，在远离等电点的碱性条件下，11S球蛋白凝胶具有较高有序性的微观结构，它们的微观结构均匀，只有少量的聚合物；酸性条件下的凝胶的微观结构有序性低于碱性条件下的凝胶，离等电点较近pH的凝胶聚合物较多，微观结构有序性低；加热温度较高的凝胶微观结构有序性优于加热温度低的。傅立叶变换红外光谱（FTIR）分析结果显示：pH7.5的凝胶随着加热温度从88℃上升到95℃，有序结构，α-螺旋和β-折叠的百分比分别从14.1%、36.3%增加到16.7%、42.1%，而无规则卷曲的百分比从10.7%减少到4.2%；pH4.15的凝胶要比pH7.5的含有更多的无规则卷曲结构而α-螺旋为零，这就导致前者的微观结构比后者的粗糙。总之，碱性条件下，较高的加热温度形成的凝胶硬度较大，且微观结构有序，这与凝胶蛋白二级结构含有较多的有序结构（α-螺旋、β-折叠和转角），较少的无规则卷曲密切相关，即凝胶蛋白二级结构中无规则卷曲向有序结构的转化，微观结构趋于有序，同时凝胶的质构性能提高。

实验研究表明，室温条件下，豫豆-25 11S球蛋白的溶解性受pH值和离子强度I的影响非常显著，而且pH与I对溶解性存在着交互作用，在等电点区域，所有离子强度的条件下，溶解性较差。在其它pH值处，溶解性随离子强度I的变化没有线性关系。通过分析得出，豫豆-25 11S球蛋白的临界胶束浓度（CMC）约为5％，低于此浓度时，有利于乳化性的提高，高于此浓度后，乳化性趋于稳定。pH值、离子强度I、温度T对乳化能力（EC）和乳化稳定性（ES）的影响有所不同，响应面方法（RSM，Response Surface Method）分析显示，随着实验条件的变化，EC的响应曲面图大都呈凹型，而ES的响应曲面图变化部分呈凸型，部分呈凹型。响应曲面图可以清晰显示出EC和ES在不同条件下的变化趋势。利用SDS-PAGE分析了豫豆-25 11S球蛋白的亚基组成及其纯度。利用显微摄像分析方法可以直观的看出乳化性能的优劣，乳化颗粒直径的大小与乳化能力EC具有相关性，而与乳化稳定性ES则无相关性。差示热量扫描（DSC）分析出不同条件下，豫豆-25 11S球蛋白的热转变温度，根据结果可以得出不同条件下的蛋白变性温度。通过DSC分析，pH值和离子强度I的改变，影响了豫豆-25 11S球蛋白热变性温度，离子强度的增加有助于提高豫豆-25 11S球蛋白的热稳定性。荧光光谱分析表明pH值和离子强度I的改变影响了豫豆-25 11S球蛋白的三、四级结构，进而影响了它的溶解性及乳化性。远紫外圆二色谱（Far-UVCD）分析出随着pH值和离子强度I的改变，豫豆-25 11S球蛋白的二级结构发生了显著的变化，进而导致了三级结构的改变。利用近紫外圆二色谱（Near-UVCD）测定了11S球蛋白三级结构的变化，与荧光分析所得的结果是一致的。

应用豫豆-25 11S球蛋白，与日本不二蛋白公司的金龟分离蛋白、国产日月星和叶县分离蛋白进行功能特性试验表明，豫豆-25 11S球蛋白的凝胶、乳化特性，远高于国产分离蛋白产品，与日本不二公司产品相当。用豫豆-25 11S大豆球蛋白进行火腿肠生产研究，实验产品的功能特性效果良好。