大豆制品中尿素酶活性测定方法
8o,PgF3W"NO0中华人民共和国专业标准 蛋 白 酶 活 力 测 定 法食品伙伴个性空间I)TCS {8N N
ZB X 66030-87 食品伙伴个性空间&D)\3w0@%H G
Measurement of proteinase activity食品伙伴个性空间5O/Wf!^w1J Tj9W
9Mu ~Kf$fQ0本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。 食品伙伴个性空间q bN
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1 福林法食品伙伴个性空间VJ;x8S7X
1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯
V!P!b"b Dy nJ01.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 食品伙伴个性空间w4e*} L-E2Nsm
1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。 食品伙伴个性空间{ ckp+T E
1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。
[h3~w]&` zl}S01.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成 0.2mol溶液(B液)。取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。 食品伙伴个性空间s6Uva ~ H&b
1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
$u&GUs _#K}01.1.6 100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。食品伙伴个性空间 PPH!i \:X-E
1.2 仪器 食品伙伴个性空间x0k7v P"k:_['I
a. 分析天平: 感量0.1mg; 食品伙伴个性空间/OnP\;B
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b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计;
t7B#@,z }0c. 水浴锅;
6m DU+^ P u-Qy0d. 1、2、5、10mL移液管等。
P4v;C'M:~ h'wP01.3 操作 食品伙伴个性空间,{#ZO/g"Wx.m5zf/R0t p
1.3.1 标准曲线的绘制 食品伙伴个性空间7~!~
NYc8o4V ~v)M#g
1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。 食品伙伴个性空间g q1G"L Y Tv
表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 食品伙伴个性空间n&DUWX
食品伙伴个性空间y@!BG[7M6z2X
试 剂 管 号 食品伙伴个性空间rn m4L |+Cl?
1 2 3 4 5 6
9Kv] v4h.Iw.H0蒸馏水,mL 10 8 6 4 2 0
pQ6_m^6A r6u0100μg/mL酪氨酸,mL 0 2 4 6 8 10
/}wG c3[0酪氨酸最终浓度,μg/ml 0 20 40 60 80 100
B$l0n.Y/p] d!fR0
[iMF] K B01.3.1.2 测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色20min在 581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD) (滤色片用65**#)或用72型分光光度计进行 测定(波长660nm)。一般测三次,取平均值。将1～6号管所测得的光密度(OD)减去1号管( 蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。食品伙伴个性空间Y:X*~l-}"\:m
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为了清楚起见。再列出表格如下 (表2)。 食品伙伴个性空间1a.s3rs#e'C5`\
表 2食品伙伴个性空间 a+]8^)\y ~P
"E+v'Eh6eyn6af&M0试 剂 管 号
LEMcC-P*j/m)l01 2 3 4 5 6 食品伙伴个性空间 S gBm jJ
按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL 1 1 1 1 1 1 食品伙伴个性空间#O#F0A'}3_4x0cU W
0.4mol/L Na2CO3,mL 5 5 5 5 5 5 食品伙伴个性空间d X$QS e
福林试剂,mL 1 1 1 1 1 1
f"^-h8r fl0O D值 1
;L_-R/xfn02 食品伙伴个性空间 Z!F2Bf;`9hz
3
} a7C`~6uzH0平均
o\3V i+Xs
Wq'v7G0净O D值 0 食品伙伴个性空间 |
o)Y/iKJ:v/{HQ?
3Off'K(S${_0以净O D值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相当的酪氨酸量K)。食品伙伴个性空间O5~,Y
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1.3.2 样品稀释液的制备。
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i _01.3.2.1 测定酶制剂: 称取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL,吸取此液5mL,再用缓冲液稀释至25mL,即成5000倍的酶粉稀释液。
YT3ba Jw_0DL4Y01.3.2.2 测定成曲酶: 称取充分研细的成曲5g,加水至100mL,在40℃水浴内间断搅拌1h,过滤,滤液用0.1mol pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)。
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d|4v01.3.3 样品测定: 取15×100mm试管3支,编号1、2、3(做2只也可),每管内加入样品稀释液1mL,置于40℃水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温10min,时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15×150mm试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤液1mL,再加0.4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂1mL,摇匀,40℃保温发色20min后进行光密度(OD)测定。空白试验也取试管3支,编号(1)、(2)、(3),测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。食品伙伴个性空间.FraU?!X
为了清楚起见,分别列出表格于下 (见表3及表4)。食品伙伴个性空间2nVb2fi4M[
表 3
9@:lr.o^.U3Z W T0食品伙伴个性空间/K!Q
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试 剂 管 号 试 剂 管 号
#q[ M.G&mg[ a$D01 2 3 (1) (2) (3)
JuXA1w L G4G_aU8p0预热酶液, mL 1 1 1 预热酶液, mL 1 1 1 食品伙伴个性空间^4aNGT`_!g M
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预热2%酪蛋白, mL 1 1 1 0.4mol三氯乙酸, mL 2 2 2 食品伙伴个性空间:I!H2xR*F.k;n
作用10min (精确计时) 作用10min (精确计时)
U,w'GSY-g00.4mol三氯乙酸, mL 2 2 2 预热2%酪蛋白, mL 1 1 1
|L}3m OU s0]q&]0表 4 食品伙伴个性空间 De2R y
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试 剂 管 号 食品伙伴个性空间cX f4_Ob"G#_L4^
1 2 3 (1) (2) (3) 食品伙伴个性空间Z(?5{ fYa|8Q
滤 液, mL 1 1 1 1 1 1
TZCoB6Y N00.4mol Na2CO3,mL 5 5 5 5 5 5 食品伙伴个性空间.R jA(p)LmN
O D值 食品伙伴个性空间uI m ^
R
平均O D值 食品伙伴个性空间8Gf0j5Wq3V ?
净O D值 食品伙伴个性空间C:P1E;k]
食品伙伴个性空间#CE,DIHk$C
样品的平均光密度(O D)一空白的平均光密度(OD)=净OD值。
1t(E\:`6wf~01.4 计算 在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。食品伙伴个性空间k9FaDN&`r
A
