酶法水解大豆分离蛋白的研究

摘  要：以大豆分离蛋白为原料，通过单因素试验和正交试验L9（34）研究了蛋白液的浓度、水解的温度、水解时间、酶的加入量及pH值等因素对大豆分离蛋白水解度的影响，确定了适宜的范围值和因素组合。试验结果表明,大豆分离蛋白在蛋白液浓度8%，加入的酶量为14μl，水解温度50℃，水解时间6h，pH值为6.5时水解率最高，水解率可达到10.0%以上。
关键词：大豆分离蛋白；中性蛋白酶；水解

将大豆蛋白质水解可以改善大豆蛋白质的品质，提高营养价值，进一步改善其溶解性、起泡性等功能特性，促进大豆蛋白在食品工业中的应用［1，2］。与酸法和碱法相比，酶法水解大豆蛋白水解效率高，反应条件温和，产生毒性物质的可能性较小；同时随着酶反应的进行，蛋白质的分子量逐渐变小，并转化为肽或者氨基酸，其物理性状及机能特性都发生明显变化，在营养学上比蛋白质和氨基酸具有更多的优点［3～5］。
1  材料与设备
1.1  试验材料
大豆分离蛋白，哈尔滨生物制药有限公司；A.S1398中性蛋白酶，哈尔滨生物制药有限公司；茚三铜溶液，氯化亚锡，pH值为8的缓冲溶液，pH为7的磷酸钠溶液，6M/1盐酸溶液，36%的盐酸溶液，1M/1氢氧化钠溶液，5%的氢氧化钠溶液。
1.2  试验设备
HH-1数显恒温水浴锅，江苏荣华仪器制造有限公司；722S分光光度计，上海分析仪器总厂；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；pHS-3C精密计，上海精密科学仪器有限公司；KDN-08C凯氏定氮仪，上海新嘉电子有限公司；XHL-16C数控硝化炉，上海新嘉电子有限公司；0.5-10μl芬兰可调式移液器，上海累勃分析仪器有限公司；FA（N）A（N）系列电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司。
2  方法
2.1  分析方法
样品总氮的测定方法采用GB6432—86，大豆分离蛋白的水解度选用分光光度法。
2.1.1  大豆蛋白水解的测定  大豆蛋白水解的测定采用校正后的茚三铜比色法即利用水解原料的完全水解液作为标准，使结果更接近真实值。
2.1.2  完全水解蛋白液的制备  取大豆蛋白25mg，放入反应瓶中加入25mg6M盐酸，拧紧瓶盖，100℃水解24h，冷却，过滤，滤液旋转蒸发器浓缩至0.5ml左右，加蒸馏水，用1MNaOH中和至中性（pH值6），定容至25ml。
2.1.3  工作曲线的绘制  取完全水解液0.1～0.8ml于25ml比色管中，蒸馏水稀释至2ml，加pH值为8的缓冲溶液0.5ml，茚三铜溶液0.5ml，沸水浴加热16min，冷却，蒸馏水稀释至25ml。570nm下测光密度，以蒸馏水为参比。另取25mg蛋白质，加水25ml，振荡均匀后过滤，取相应体积的滤液，按上述方法测光密度值。以相同体积样品的光密度之差与蛋白质含量做工作曲线。结果见表1。
表1  完全水解蛋白液与为水解蛋白液的吸光度之差
 蛋白含量（mg） 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
 吸光度之差   0.129 0.298 0.343 0.511 0.584 0.708   0.864 1.071
2.1.4  水解度的测定  取水解后灭酶的水解液1ml，稀释至100ml，过滤，取滤液2ml，加pH值8的缓冲溶液0.5ml，茚三铜溶液0.5ml，沸水浴加热16min，冷却，用蒸馏水稀释至25ml，在570nm下测光密度，以蒸馏水做参比。另取相同浓度未水解蛋白溶液2ml，按上述方法测光密度，以二者光密度之差从工作曲线上查蛋白质含量，按下式计算水解度：

式中A为查表得蛋白质的mg数；W为称样重，g；V1为水解液的总体积，ml；V2为显色时所用稀释液的体积，ml。
2.2  中性蛋白酶水解工艺的确定［6］
2.2.1  酶/底物对水解度的影响  称取4份0.4g大豆分离蛋白，分别加入pH值7.0磷酸钠溶液20ml，在95℃下处理20min，（以下的酶水解都在相应的温度下预处理之后再加酶）。然后准确量取中性蛋白酶10μl、12μl、14μl、16μl分别加入。pH值6.5，45℃水浴中水解6h，之后沸水浴中灭酶活20min，分别取1ml测水解度。
2.2.2  大豆分离蛋白浓度对水解度的影响  分别配置浓度为4%、6%、8%、10%的大豆蛋白溶液。预处理同上。控制条件：最适酶底物浓度为14μl，pH值6.5，温度45℃水浴中水解6h，之后沸水浴中灭酶20min，分别取1ml测水解度。
2.2.3   pH值对水解度的影响［7］  分别配置pH值为6.5、7.0、7.5、8.0的大豆蛋白液。预处理同上。控制条件：酶/底物浓度14μl，大豆分离蛋白浓度8%，温度为45℃水浴中水解6h，之后沸水浴中灭酶20min，分别取1ml测水解度。
2.2.4  温度对水解度的影响  配置溶液浓度为8%大豆分离蛋白溶液。预处理同上。控制条件：加入14μl的中性蛋白酶，控制pH值7.0。分别在40℃、45℃、50℃、55℃的水浴中加热水解6h，之后在沸水浴中灭酶20min，分别取1ml测水解度。
2.2.5  时间对水解度的影响  配置溶液浓度为8%大豆分离蛋白溶液。预处理同上。加入14μl的中性蛋白酶，控制pH值7.5，温度为50℃。分别水解4h、5h、6h、7h，之后在沸水浴中灭酶20min，分别取1ml测水解度。
3  结果与讨论
3.1  中性蛋白酶水解工艺条件的确定

3.1.1  酶/底物浓度与水解度之间的关系  酶/底物浓度与水解度之间的关系如表2。
表2  酶底物的浓度与水解度之间的关系
 蛋白重（g）   0.4035   0.4027   0.4033   0.4034
 蛋白酶的加入量（μl）   10   12   14   16
 吸光度   1.510   1.595   1.630   1.555
 水解度（%）   8.03   9.58   10.50   8.83
由表2可以看出，随着酶用量的增大，蛋白液的水解度升高。当酶的用量超过14μl以后，蛋白液的水解度又下降。这主要是因为由于酶浓度过大发生自溶（自水解）现象，导致对底物水解作用减弱。所以酶的最佳用量为14μl。
3.1.2  大豆分离蛋白浓度与水解度之间的关系  大豆分离蛋白浓度与水解度之间的关系如表3。
表3  大豆分离蛋白浓度与水解度之间的关系
 蛋白重（g）   0.4035   0.6024   0.8010   1.1009
 蛋白液的浓度（%）   4   6   8   10
 吸光度   1.615   1.759   2.133   1.650
 水解度（%）   9.35   9.63   10.70   8.36
由表3可以看出，随着蛋白液浓度的增大，蛋白液的水解率呈上升趋势，浓度为8%时的水解率较大。随着浓度的继续增大水解率呈下降趋势，说明蛋白液的浓度增大，导致酶底物浓度低，酶促反应速度下降，水解下降。
3.1.3  pH值与水解度之间的关系  pH值与水解度之间的关系见表4。
表4  pH值与水解度之间的关系
 蛋白重（g）   0.802   0.7999   0.8038   0.8012
 pH值（D）   6.5   7.0   7.5   8.0
 吸光度   2.088   2.199   2.034   2.021
 水解度（%）   10.15   10.73   9.69   9.59
由表4可以看出，pH值为7.0时水解度最大。这是由于酶作为一种特殊的蛋白质分子，其酶催化反应的能力与环境pH值密相关，环境pH值会影响酶分子的构像和酶分子及底物分子的解离状态，从而影响酶的活性和酶促反应速度，pH值过高、过低均对酶促反应不利。
3.1.4  温度与水解度之间的关系  温度与水解度之间的关系见表5。
表5  温度与水解度之间的关系
 蛋白重（g）   0.8021   0.8010   0.8001   0.8035
 温度（℃）   40   45   50   55
 吸光度   2.054   2.088   2.233   2.069
 水解度（%）   9.84   10.25   10.85   9.99
由表5可以看出，在50℃时蛋白液的水解率最高，故中性蛋白酶水解最适温度为50℃。温度对酶促反应的影响有两个方面，一是温度提高可使反应速度加快；二是随着温度的提高，酶失活速度也开始加快。本试验使用HH-6数显恒温水浴锅温度，其恒定效果好，使数据差距较小。
3.1.5  时间与水解度之间的关系  时间与水解度之间的关系见表6。
表6  时间与水解度之间的关系
 蛋白重（g）   0.8012   0.8035   0.8008   0.8015
 时间（h）   4   5   6   7
 吸光度   2.047   2.099   2.251   2.261
 水解度（%）   9.79   10.30   10.89   10.91
由表6可以看出，蛋白的水解率随着时间的延长而增大。一般来讲，要达到同样的水解率，水解时间同酶的用量有关，酶的用量大，水解时间可以短些。加酶量相同，时间越长，水解率越高，但达到一定的时间后上升趋势减缓，综合考虑到能耗、生产周期及防止水解液变质等因素，以水解时间不宜超过6h为宜。
3.2  A.S1398中性蛋白酶的水解蛋白液的最佳工艺条件试验
在用中性蛋白酶水解蛋白液的过程中，为了确定蛋白液的最佳水解条件，以蛋白液的水解率为实验的考察指标，对酶的用量、温度、时间及pH这4个因素（分别以A、B、C、D表示）安排L9（34）正交试验，固定蛋白液的浓度为8%，根据正交试验，计算极差（R）的大小，可知道在设定的水平范围内各因素对试验指标的影响程度，并确定最佳工艺，试验因素水平表见表7，蛋白液水解的正交试验表见表8。
表7  蛋白液水解因素水平表
 水平   加入酶量A（μl）   温度B（℃）   时间C（h）   pH D
 1   12   45   4   6.6
 2   14   50   5   7.0
 3   16   55   6   7.5
表8  蛋白液水解正交试验表L9（34）
 水平 酶的用量A   温度B   时间C   pH 水解率（%）
 1   1   1   1   1   9.15
 2   1   2   2   2   10.02
 3   1   3   3   3   9.40
 4   2   1   2   3   9.83
 5   2   2   3   1   10.45
 6   2   3   1   2   9.99
 7   3   1   3   2   10.14
 8   3   2   1   3   9.45
 9   3   3   2   1   9.21
 T1   28.57   29.13   28.59   28.81
 T2   30.27   29.92   29.06   30.15
 T3   28.80   28.60   29.99   28.68
 X1   9.52   9.70   9.53   9.60
 X2   10.09   9.97   9.69   10.05
 水平 酶的用量A   温度B   时间C   pH 水解率（%）
 X3   9.60   9.53   10.00   9.56
 R   0.57   0.44   0.47   0.49
由表8结果可知，表中四个因素对蛋白液的水解度影响的主次关系为A>D>C>B，最佳因素组合为A2D2C3B2，即加入A.S1398中性蛋白酶14μl，温度控制在50℃，水解时间为6h，pH值为6.5，固定蛋白液的浓度为8%时蛋白液的水解率最高。
4  结论
通过对A.S1398中性蛋白酶对大豆蛋白的水解条件的探索，蛋白液水解时的浓度固定在8%时有利于水解的进行。通过单因素实验和正交实验得出蛋白液的水解最佳条件：蛋白液的浓度为8%、酶的加入量为14μl、温度为50℃、时间为6h、pH值为6.5。酶的加入量是蛋白液水解的主要影响因素，其次是pH，A.S1398中性蛋白酶在环境是中性的条件下水解作用最强。
实验结果得出的大豆分离蛋白的水解率为10.0%左右，低于参考资料的14.0%，原因可能是购买的A.S1398中性蛋白酶的活力为100000U/g，低于参考资料上230000U/g的标准，致使大豆分离蛋白的水解率偏低。◇

参考文献
［1］范恒君.酶法水解植物蛋白.南宁职业技术学院学报，2000，3：57-62.
［2］汪秋安.蛋白水解物的生产与应用.食品工业科技，1999，4：66-67.
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［4］王孝英.植物蛋白水解复合酶的研究.食品工业科技，2002，9：37-38.
［5］李书国.大豆多肽饮料加工工艺研究.西部粮油科技，1999，5：39-42.
［6］ChenG,etal.Effects of Hydrophobicity on Utilization of Peptides by Runminal Bacteria.in Vitro Appl Environ Micobiol，1987，53：20-211.
［7］J J Roza,etal.Poitenin V.Enzymic Protein Hydroly-sates.Nitrogen in Starved Rars.Rrit J Nuti，1995，73：65-71.